The purpose of the study is to evaluate the phenotypic and genetic potential of E. coli strains isolated from cats with diseases of the urinary system. The test material was 12 strains of E. coli isolated from the urine of cats with diseases of the urinary system by conventional methods and identified by mass spectrometry. The pathogenic and persistent properties of bacteria were determined by the photometric method. Resistance to fluoroquinolones was determined by the disk diffusion method. Genes that determine the synthesis of adhesins, colonization and persistence factors, and antibiotic resistance were detected using polymerase chain reaction (PCR) using selected primers. E. coli were characterized by a pronounced pathogenic potential. The features of culture bioprofiles were determined by the expression of the studied biological properties: the hemolytic activity in bacteria isolated in associations was significantly higher than in strains isolated in a monoculture and, on the contrary, in monocultures, the values of the ability of E. coli to biofilm formation and adhesion were significantly higher. E. coli showed sensitivity, moderate resistance and resistance to drugs from the group of fluoroquinolones. PCR revealed the presence of genetic determinants of virulence (papA, fimH, fyuA, kspMTII, hlyA) and resistance (gyrA, parC, gnrB, gnrS) in all isolates, as well as the usp and grnA genes in the vast majority. The obtained data on the pathogenic bioprofile of E. coli isolated in the pathology of the urinary system in cats can be used as a criterion for the search and identification of the pathogen. The established resistance to fluoroquinolones in E. coli isolates indicates the need to control their use. Regional monitoring of bacterial resistance to antibacterial drugs is essential for successful therapy.
: E. coli, diseases of the urinary system, cats, bioprofile of pathogens, genes, determining factors of virulence and resistance to fluoroquinolones
Введение. Патологии почек и мочевыводящих путей играют одну из ведущих ролей в нозологии незаразных заболеваний мелких домашних животных и представляют важную проблему для ветеринарной медицины. В видовом спектре микроорганизмов, выделенных из мочи кошек при циститах и мочекаменной болезни, наряду с бактериями рода Staphylococcus выявлено доминирование E. coli [1]. Известно, что кишечная палочка может способствовать развитию инфекционно-воспалительных осложнений, а также рецидиву заболевания, это обусловлено спектром биологических свойств микроорганизмов, инициирующих воспалительный процесс [2]. Однако информации, касающейся биопрофиля E.coli, выделенных от кошек с заболеваниями мочевыводящей системы, не достаточно.
Цель исследования – фенотипическая и генетическая оценка патогенного потенциала штаммов E. coli, изолированных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы.
Условия, материалы и методы. В работе были изучены 12 штаммов E. coli, выделенных из мочи 54 кошек с патологией мочевыделительной системы (мочекаменная болезнь и цистит) и находящихся на лечении в ветеринарных клиниках г. Оренбурга. Пробы мочи получали от больных животных методом катетеризации и доставляли на исследование в течение 1–2 ч. Выделение бактерий проводили стандартными методами. Видовую идентификацию осуществляли с помощью масс-спектрометра MALDI TOF MS серии Microflex LT (BrukerDaltonics, Германия) и программного обеспечения MaldiBioTyper 3,0. Антилизоцимную активность (АЛА), биопленкообразование (БПО), гемолитическую активность (ГА) и показатель адгезии микробных клеток (ПА) определяли стандартными фотометрическими методами. Резистентность к фторхинолонам (энрофлоксацину, ципрофлоксацину, норфлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину) определяли диско-диффузионным методом [3]. Бактериальную дезоксирибонуклеиновую кислоту экстрагировали с помощью реактивов «ДНК-экспресс» («Литех», Россия). Циклический синтез фрагментов ДНК осуществляли с использованием амплификатора «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия). Для определения наличия генов вирулентности и резистентности использовали специфические олигонуклеотидные праймеры, описанные в научных публикациях [4–6] и синтезированные фирмой «Синтол» (Россия) (табл.).
Праймеры, использованные при мультиплексной ПЦР, и размеры ампликонов
|
Ген |
Функция |
Праймеры |
Нуклеотидная последовательность |
Размер, п.н. |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
|
Адгезины |
|||||
|
1 |
P-пили, ассоциированные с пиелонефритом |
pap A For |
ATGGCAGGTGGTGTTTTGGTG |
720 |
|
|
pap A Rev |
CGTCCCACCATACGTGCTCTTC |
||||
|
2 |
Фимбрии 1-го типа, покрытые белком адгезином |
fimH F |
TCGAGAACGGATAAGCCGTGG |
508 |
|
|
fimH R |
GCAGTCACCTGCCCTCCGGTA |
||||
|
3 |
Афимбриальный фактор адгезии |
afa For |
GCTGGGCAGCAAACTGATAACTCTC |
750 |
|
|
afa Rev |
CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG |
||||
|
Система захвата и транспорта железа |
|||||
|
4 |
Ген, отвечающий за синтез сидерофора йерсинеабактина |
fyuAFor |
TGATTAACCCCGCGACGGGAA |
880 |
|
|
fyuARev |
CGCAGTAGGCACGATGTTGTA |
||||
|
Белки синтеза полисахаридов капсулы |
|||||
|
5 |
Белок II группы, синтезирующий полисахарид капсулы |
kpsMTII For |
GCGCATTTGCTGATACTGTTG |
270 |
|
|
kpsMTII Rev |
CATCCAGACGATAAGCATGAGCA |
||||
|
Нуклеазы |
|||||
|
6 |
Уропатогенный специфический белок |
usp For |
ACATTCACGGCAAGCCTCAG |
440 |
|
|
usp Rev |
AGCGAGTTCCTGGTGAAAGC |
||||
|
Токсин |
|||||
|
7 |
Гемолизин |
hlyA F |
AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT |
1 177 |
|
|
hlyA R |
ACCATATAAGCGGTCATTCCCGTCA |
||||
|
Гены резистентности к фторхинолонам (энрофлоксацин, офлоксацин, левофлоксацин) |
|||||
|
8 |
Ген, кодирующий ДНК-гиразу |
gyrA-P1 gyrA-P3 |
TGT CCG AGA TGG CCT GAA GC TGC CGT CAT AGT TAT CAA CGA |
374 |
|
|
9 |
Ген, кодирующий топоизомеразу IV |
parC-3 parC-4 |
CCG TGC GTT GCC GTT TAT TG AAGTGCCGTCGAAGTTTGGCA |
368 |
|
Окончание табл.
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
10 |
Плазмид-опосредованные гены устойчивости к хинолонам |
qnrA-1 qnrA-2 |
ATTTCTCACGCCAGGATTTG GATCGGCAAAGGTTAGGTCA |
516 |
|
11 |
qnrB-1 qnrB-2 |
GATCGTGAAAGCCAGAAAGG ACGATGCCTGGTAGTTGTCC |
469 |
|
|
12 |
qnrS-1 qnrS-2 |
ACGACATTCGTCAACTGCAA TAAATTGGCACCCTGTAGGC |
417 |
Статистический анализ результатов осуществлен с применением программ MS Excel 2007.
Результаты и обсуждение. При бактериологическом исследовании мочи E. coli были выделены в 22,2 % случаев, в 33,3 % микроорганизмы были в виде монокультуры, в 66,7 % – в ассоциациях с другими микроорганизмами (S. aureus, S. intermedius, E. faecalis, K. pneumonia). У выделенных E. coli определен комплекс биологических свойств (биопрофиль), включающий их вирулентные и персистентные характеристики, а также антибиотикорезистентность. Частота обнаружения ГА, БПО и АЛА составляла 100 %, способностью к адгезии характеризовались 66,7 % E. coli. Среднее значение ГА у исследованных штаммов E. coli было равно 6,8 ± 0,85 %, выраженность АЛА составила 1,1 ± 0,05 мкг/мл, а способность образовывать биопленки – 1,43 ± 0,42 у. е.
Далее была определена чувствительность E. coli к фторхинолонам, которые являются оптимальными препаратами для эмпирической терапии неосложненных инфекций как верхних, так и нижних мочевых путей. Выявлено, что по отношению к ципрофлоксацину половина изученных штаммов проявляла чувствительность, а вторая половина – умеренную резистентность; к энрофлоксацину чувствительных штаммов не было, при этом 16,7 % культур характеризовались резистентностью и 83,3 % – умеренной резистентностью. К норфлоксацину все исследованные E. coli проявляли чувствительность, к офлоксацину и левофлоксацину по 16,7 % культур были умеренно резистентными, остальные чувствительными.
Сравнительный анализ распространенности изученных свойств у E. coli, выделенных в монокультуре и ассоциациях, выявил их отличие по способности к биопленкообразованию (50 % штаммов, выделенных в ассоциациях и 100 % изолятов в монокультуре) и адгезии (75 и 50 % соответственно). Установлено, что ГА изолятов E. coli в ассоциациях составила 7,7 ± 0,09 %, тогда как у монокультур – 5,1 ± 0,36 % (p < 0,01), и, напротив, значения БПО и ПА были выше у монокультур (1,7 ± 0,07 и 1,1 ± 0,13 у. е., р < 0,05; 17,0 ± 0,03 и 11,9 ± 0,89 %, р < 0,05). По уровню АЛА выделенные штаммы не отличались (рис.).
|
*** |
|
* |
|
* |
|
** |
Биопрофили E. coli, выделенных в монокультуре и ассоциациях при цистите и МКБ:
БП – биопленкообразование, у. е.; АЛА – антилизоцимная активность, мкг/(мл·ОП);
ГА – гемолитическая активность, %; ПА – показатель адгезии, %; (*) – р ≤ 0,05; (**) – р ≤ 0,01
Затем был охарактеризован вирулентный потенциал штаммов E. coli на уровне генотипа. Установлено, что у всех выделенных культур регистрировались следующие гены, ответственные за адгезию: fim H и pap A и отсутствовали гены afa B и afa C. Это связано с тем, что у грамотрицательных микроорганизмов функцию распознавания и прикрепления осуществляют пили, или фимбрии, а у грамположительных бактерий в адгезии участвуют афимбриальные структуры. Встречаемость данного фактора среди уропатогенных штаммов достаточно сильно варьирует, так, в исследованиях [7] у 45 изолятов эшерихий, выделенных от собак и кошек с инфекциями мочевыводящих путей, не обнаружен ген afa, что согласуется с полученными нами данными. Установлено наличие у всех изолированных нами E. coli гена kps M, детерминирующего синтез капсульного полисахарида, защищающего от иммунной системы хозяина, а также гена hly A, относящегося к порообразующим токсинам, лизирующим эритроциты и ядросодержащие клетки. Ген usp, кодирующий уропатогенный специфичный протеин, выявлен нами у 83,3 % E. coli. Известно, что выработка сидерофоров, определяющих способность бактериальных клеток к захвату железа, повышает жизнеспособность микроорганизмов внутри уретрального тракта и активируется во время инфекции. Показано, что экспрессия сидерофоров повышена в уропатогенах по сравнению с комменсальными штаммами E. coli [8], что демонстрируют проведенные нами исследования, установившие присутствие гена fyu A у всех выделенных изолятов. У всех изученных штаммов также выявлены гены gyr A и par С, ответственные за формирование устойчивости к фторхинолонам, гены qnr B и qnr S, кодирующие белки, уменьшающие связывание хинолона с ДНК и последующее образование комплекса хинолон-гираза; при этом только 66,7 % культур характеризовались наличием гена qrn A.
Проведенный анализ биопрофиля E. coli, выделенных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы, показал, что данные микроорганизмы, как в монокультуре, так и ассоциациях, характеризуются выраженным патогенным потенциалом, который определяется наличием у них комплекса вирулентных и персистентных свойств, включая ГА, АЛА, БПО, адгезию, антибиотикорезистентность. Таким образом, вирулентный биопрофиль E. coli можно применять как критерий скрининга у больных животных возможных возбудителей заболеваний для последующей селективной элиминации. С другой стороны, настораживает факт значительного распространения генов резистентности к антибиотикам из группы фторхинолонов, которые являются препаратами выбора. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фторхинолоны должны использоваться для терапии заболеваний мочевыделительной системы только после определения чувствительности E. coli к антибиотикам данной группы.
Заключение
1. Штаммы, выделенные из мочи кошек с заболеваниями мочевыделительной системы, характеризуются определенным биопрофилем и выраженным патогенным потенциалом.
2. Молекулярно-генетическим методом у уроизолятов с высокой частотой определено наличие генов, кодирующих адгезины, факторы колонизации и персистенции, а также резистентность к фторхинолонам.
1. Vidovoy sostav i rezistentnost' k antibiotikam mikroorganizmov, vydelennyh pri patologii mochevydelitel'noy sistemy u plotoyadnyh / N.V. Morozova [i dr.] // Vestnik Buryatskoy gosudarstvennoy sel'skohozyaystvennoy akademii im. V.R. Filippova. 2020. № 1 (58). S. 66–72.
2. Harakteristika patogennogo potenciala Escherichia coli, vydelennyh u pacientov s kal'kuleznym pielonefritom / T.M. Pashkova [i dr.] // Urologiya. 2021. № 4. S. 19–24.
3. MUK 4.2.1890-04. Opredelenie chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam. M.: Minzdrav Rossii, 2005. 62 c.
4. Johnson J.R., Stella A.L. Extended virulence genotypes of Escherichia coli strains from patients with urosepsis in relation to phylogeny and host compromise // J. Infect. Dis. 2000. Vol. 181. P. 261–272.
5. Detection of urovirulence factors in Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction / S. Yamamoto [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. Vol.12. P. 85–90.
6. The genetic background of antibiotic resistance among clinical uropathogenic Escherichia coli strains / W. Adamus-Białek [et al.] // Mol. Biol. Rep. 2018. Vol. 45 (5). P. 1055–1065.
7. Babacan O., Izgür M. Detection of virulence factors of Escherichia coli strains isolated from urogenital system infections in dogs and cats // Vet. Hekim. Der. Derg. 2021. Vol. 92(2). P. 132–142.
8. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options / A.L. Flores-Mireles [et al.] // J. Nat. Rev. Microbiol. 2015. Vol. 13(5). P. 269–284.
