Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
The aim of the research is to estimate the changes in the process of regeneration of airway epithelial lining of rats of different age under general cooling of the body. The research was done on 60 white outbread mice at the age of 6-7 months (young) and 19-20 months (old). Each group included 2 subgroups: the first one had intact animals; the second one consisted of animals which were subject to general cooling during 14 days by 3 hours daily at the temperature of -15ºC. Cranial and caudal parts of trachea mucosa and the wall of intralobular bronchus (of a small calibre) were the object of the research. It was found out that with the general cooling of the body in the epithelium of the cranial and caudal trachea in old animals compared with young rats there was indicated a significant reduction in the number of basal and especially intermediate cells, and the increase in the number of goblet ones. The increase in the number of epithelial cells, primarily of intermediate ones in the state of extrusion, was found out. In small bronchi in old rats the number of ciliated cells decrease whereas their destructive changes increase and the number of Clara cells in the elimination of the state grow. The effect of low temperatures leads to the activation of lipid peroxidation reactions against the decrease of the contents of vitamin E in the lungs of rats, especially the older animals.
multi-row ciliated epithelium, Clara cells, trachea, bronchi, cells extrusion, low temperature, lipid peroxidation reaction.
Основную роль в реализации защитных функций слизистой оболочки органов дыхания играет эпителиальная выстилка, обеспечивающая пролиферацию и дифференцировку клеток [4]. Неблагоприятные факторы окружающей среды, особенно низкие температуры, оказывают негативное влияние на все структуры воздухоносных путей [6, 7]. В норме в тканях организма постоянно протекает процесс липидной пероксидации, интенсивность которого находится в обратной зависимости от активности естественной антиоксидантной системы. Избыточное образование активных форм кислорода может быть причиной повреждения и гибели клеток [3] и, как результат, нарушаются процессы, обеспечивающие внутритканевые регуляторные механизмы. Известно, что убыль эпителиоцитов дыхательных путей реализуется не только путем апоптоза, но и путем элиминации морфологически жизнеспособных элементов [9, 10, 12]. Реакция клеток и тканей на воздействие низких температур также зависит от возраста организма, так как по мере старения происходит снижение уровня метаболических процессов, что приводит к избыточному накоплению продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), активации окислительного стресса и развитию патологического процесса в структуре эпителиального пласта [1, 3, 8, 14].
Цель работы – оценка изменений процесса регенерации эпителиальной выстилки органов дыхания крыс различного возраста при общем охлаждении организма.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на 60 беспородных белых крысах, в возрасте: 6-7 месяцев (молодые) и 19-20 месяцев (старые). Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам биологической этики, изложенным в Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985), Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986), Приказе МЗ СССР №755 от 12.08.1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», Приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».
При завершении научных исследований выведение животных из опыта проводили путем декапитации с соблюдением требований гуманности согласно приложению №4 к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных − приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1977 «О порядке проведения эвтаназии (умерщвления животного)». Исследование одобрено Этическим комитетом Амурской государственной медицинской академии.
При распределении животных по возрасту учитывали этапы развития крыс [2]. В соответствии с поставленной задачей подопытные животные были разделены на две основные группы (молодые и старые), каждая из них включала по 2 подгруппы: 1 – интактные крысы; 2 – животные, которых подвергали общему охлаждению в течение 14 дней по 3 часа ежедневно при температуре -15ºС. Объектом исследования были краниальный и каудальный отделы слизистой оболочки трахеи и стенка внутридолькового бронха (малого калибра). Для этого вырезали из соответствующих отделов кусочки тканей размером 1×1 мм, материал фиксировался в течение 1 часа в 2,5% растворе глютаральдегида на 0,05 М какодилатном буфере рН 7,4. Обезвоживание материала осуществляли в спиртах восходящей концентрации. После проводки образцы тканей заливали в смесь эпона и аралдита. Полимеризацию проводили при температуре 60ºС. Из полученного материала изготавливали полутонкие срезы, которые окрашивали толуидиновым синим. Фотографирование осуществляли на микроскопе Primo Star (Германия). Проводили подсчет основных типов эпителиоцитов в составе краниального и каудального отдела трахеи (базальные, промежуточные, бокаловидные, реснитчатые), а также внутридолькового бронха (реснитчатые, клетки Клара) на 100 мкм длины эпителиального пласта. Биохимическому исследованию подвергали ткань легкого. Для определения продуктов ПОЛ и витамина Е липиды из тканей легкого экстрагировали по методу Блайя-Дайера (1975). Диеновые коньюгаты определяли методом И.Д.Стальной, гидроперекиси липидов – методом Л.А.Романова и И.Д.Стальной, количество витамина Е – по методу Р.Ж.Киселевича и С.И.Скварко. Статистическую обработку проводили при помощи статистического пакета Statistica 6.0.
Результаты исследования и их обсуждение
Внутренняя выстилка слизистой оболочки проксимального отдела дыхательных путей (трахея) представлена многорядным призматическим реснитчатым эпителием, расположенным на базальной мембране. В толще эпителиального пласта, как в краниальном, так и в каудальном отделах трахеи, наблюдается процесс элиминации, что морфологически проявляется изменением места локализации клетки, появлением на поверхности участка цитоплазмы, далее ядросодержащий части и затем окончательным выделением клетки из пласта. У интактных молодых крыс, по сравнению со старыми животными, почти в два раза реже присутствуют эпителиоциты в состоянии экструзии. У старых крыс достаточно часто встречаются реснитчатые клетки в процессе элиминации, как без морфологических изменений, так и с признаками частичного разрушения реснитчатого аппарата и структурной перестройки ядра. При охлаждении организма с составе эпителия увеличивается число тучных и бокаловидных клеток, часто элиминируют элементы, на апикальной поверхности которых отсутствуют реснички, и, учитывая особенности структуры ядра, есть основания предположить, что это промежуточные клетки (рис. 1А). Последние являются переходными формами на пути развития реснитчатых и бокаловидных клеток из базальных элементов (рис. 1А). Причем число промежуточных клеток у старых животных на 30% больше, чем у молодых [11]. У старых крыс в эпителиальном пласте встречаются зоны гипертрофированных реснитчатых клеток, присутствуют дегенеративно измененные элементы с признаками дистрофии цитоплазмы и ядра. Значительно снижается количество базальных клеток, большинство из которых имеют измененные ядра (рис. 1Б). Увеличение числа реснитчатых и промежуточных элементов в процессе экструзии, как в краниальном, так и каудальном отделах трахеи, примерно одинаково. Во внутридольковых бронхах в составе эпителия присутствуют реснитчатые клетки и клетки Клара, последние входят в состав непрерывной выстилки бронхиол, которая является продолжением эпителиального пласта проксимальных дыхательных путей. Клетки Клара играют роль прогениторных клеток эпителия бронхиол, они способны к самообновлению собственной популяции и к дифференцировке в реснитчатые клетки [13]. У молодых интактных крыс в малом бронхе реснитчатые клетки в основной имеют обычный план строения, между ними располагаются клетки Клара, содержащие немногочисленные гранулы и сохраняющие контакт с базальной мембраной. У старых крыс в некоторых реснитчатых клетках появляется вакуолизация цитоплазмы, часть клеток Клара утрачивает контакт с базальной мембраной. При действии низких температур в составе эпителия у молодых крыс увеличивается число реснитчатых клеток, среди них наблюдаются картины митоза клеток Клара (рис. 2А). У старых животных при общем охлаждении почти на 20% снижается число реснитчатых клеток, многие из них имеют дегенеративно измененные ядра, вакуолизированную цитоплазму (рис. 2Б).
|
  |
    
  |
|||||||||
|
Рис. 1. Слизистая оболочка каудального отдела трахеи крыс при общем охлаждении организма. А – молодые (6-7 месяцев); Б – старые (19-2 месяцев). Эпителиальный пласт сохраняет типичный план строения. Наблюдаются явления экструзии промежуточных клеток (↑). Выявляются тучные клетки (Тк). Некоторые реснитчатые клетки (Рк) имеют светлую цитоплазму. Базальные клетки (Бк) прилежат к базальной мембране. Полутонкий срез. Окраска: толуидиновым синим. Увеличение: А – 1000; Б – 1200.
|
||||||||||
|
   
  |
   
  |
|||||||||
|
Рис. 2. Слизистая оболочка малого бронха крыс при общем охлаждении организма. А – молодые (6-7 месяцев); Б – старые (19-20 месяцев). На базальной мембране располагаются реснитчатые клетки (Рк). На поверхности находятся клетки Клара (↑). Полутонкий срез. Окраска: толуидиновым синим. Увеличение: 1000. |
||||||||||
Таблица
Показатели продуктов ПОЛ и антиоксидантной системы в ткани легкого у крыс различного возраста (интактные животные и на фоне действия низкой температуры)
|
Показатели |
Группы животных |
|||
|
Возраст 6-7 месяцев |
Возраст 19-20 месяцев |
|||
|
Интактные |
Охлаждение в течение 14 дней |
Интактные |
Охлаждение в течение 14 дней |
|
|
Диеновые конъюгаты, нмоль/г |
43,82±1,3 |
52,57±1,82** |
45,62±1,48 |
60,47±1,45** |
|
Гидроперекиси липидов, нмоль/г |
36,12±1,11 |
45,68±1,25* |
39,05±1,56 |
44,6±1,49* |
|
Витамин Е, мкг/г |
58,95±1,93 |
43,52±1,18** |
61,72±1,87 |
42,25±1,89** |
Примечание: * – p<0,05; ** – p<0,01 – достоверность различий значений по отношению к интактной группе.
При действии низкой температуры, как у молодых, так и старых животных отмечен достоверный рост уровня ПОЛ в ткани легкого (табл.). На это указывают повышение показателей диеновых конъюгатов (у молодых животных на 16,6%, у старых на 24,6%) и гидроперекисей (у молодых животных на 21%, у старых на 12,4%). Уровень витамина Е, ответственного за антиоксидантную защиту, снижался в обоих группах, но особенно значительно у старых крыс (на 44%). Активность реакции ПОЛ в тканях контролируется антиоксидантной системой, которая обеспечивает не только защиту от повреждающего действия свободных радикалов, но и влияет на адаптационные реакции [3]. Считают, что с возрастом происходит увеличение повреждающего действия ПОЛ и его продуктов на организм, что приводит к накоплению неспецифических модификаций белков и ферментов, росту повреждений в клеточных компартментах [1].
У старых животных процесс экструзии морфологически дифференцированного эпителия встречается чаще, чем у молодых крыс [5]. Это характерно для всех отделов воздухоносных путей. Известно, что по мере уменьшения калибра бронхов и относительного увеличения в эпителии клеток с высокой функциональной специализацией доля их участия в пролиферации возрастает [11]. Необходимо иметь ввиду, что с возрастом происходят изменения эпителио-стромальных взаимодействий в эпителиальной выстилке дыхательных путей, что ведет к развитию инволютивных процессов [5, 6, 14]. Действие низкой температуры у старых животных более значительно изменяет уровень пролиферативных процессов, что может извращать направленность дифференцировки в эпителии органов дыхания.
1. Anisimov, V.N. Arutyunyan A.V., Oparina T.I., Burmistrov S.O., Prokopenko V.M., Khavinsov V.Kh. Age-related changes in the activity of free radical processes in the tissues and blood serum. Rossiyskiy fiziologicheskiy zhurnal 1999; 85(4):502–507 (in Russian).
2. Zapadnyuk I.P., Zapadnyuk V.I., Zacharia E.A., Zapadnyuk B.V. Laboratory animals. Breeding, maintenance, use in the experiment. Kiev: Naukova Dumka; 1974 (in Russian).
3. Menshchikova E.B., Lankin V.Z., Zenkov N.K., Bondar I.A. Krugovykh N.F. Trufakin V.A. Oxidative stress. Pro-oxidants and antioxidants. Moscow: Slovo; 2006 (in Russian).
4. Pavlov A.V., Yesev L.I. Methodological approaches to the complex study of the functional morphology of the tracheal epithelial lining in the experiment. Morfologiia 2012; 142(6):73–76 (in Russian).
5. Pavlov A.V., Yesev L.I. Histophysiology of the tracheal epithelium in rats in postnatal ontogenesis. Morfologiia 2014; 146(6):80–86 (in Russian).
6. Polyakova V.S., Zavaleeva S.M., Stadnikov A.A. Structural reorganization of pneumatic and respiratory parts of the lungs under the influence of adverse factors of air pollution. Vestnik Orenburgskogo Gosudarstvennogo Universiteta- 2003; 1:66–69 (in Russian).
7. Tseluyko S.S., Krasavina N.P., Semenov D.A., Gorbunov M.M., Zhou X.D., Li Q. Modern views on issues of proliferation and differentiation of respiratory stem cells in norm and cold exposure. Bûlleten' fiziologii i patologii dyhaniâ 2012; 45:98–103 (in Russian).
8. Bailey K.L., Bonasera S.J., Wilderdyke M., Hanisch B.W., Pavlik J.A., DeVasure J., Robinson J.E., Sisson J.H., Wyatt T.A .Aging causes a slowing in ciliary beat frequency, mediated by PKCε. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2014; 306(6):L584–L589.
9. Bird J.E., Daudet N., Warchol M.E., Gale J.E. Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner. J. Neurosci. 2010; 30(37):12545–12556.
10. Eisenhoffer G.T., Loftus P.D., Yoshigi M., Otsuna H., Chien C.B., Morcos P.A., Rosenblatt J. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature 2012; 484(7395):546–549.
11. Emura M. Stem cells of the respiratory tract. Paediatr. Respir. Rev. 2002; 3(1):36–40.
12. Marinari E., Mechonic A., Curran S., Gale J., Duke T., Baum B. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature 2012; 484(7395):542–545.
13. Rawlins E.L., Okubo T., Xue Y., Brass D.M., Auten R.L., Hasegawa Y., Wang F., Hogan B.L.M. The role of Scgb1a1+ Clara cells in the long-term maintenance and repair of lung airway, but not alveolar, epithelium. Cell Stem Cell 2009; 4(6):525–534.
14. Rosenblatt J., Raff M.S., Cramer L.P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr. Biol. 2001; 11(23):1847–1857.
