employee
Moskva, Moscow, Russian Federation
employee
Moskva, Moscow, Russian Federation
employee
Moskva, Moscow, Russian Federation
employee
Moskva, Moscow, Russian Federation
employee
Moskva, Moscow, Russian Federation
employee
Moskva, Moscow, Russian Federation
New strategy for the treatment of animal infectious diseases is based upon the modulation of the host immune response in order to enhance the clearance of infectious agents and reduce the damaging effects of inflammation in the tissues. The modern approach to the use of immunomodulators (IMD) in veterinary practice consists in the usage of such drugs, which are not only immunomodulating, but also have antiviral, antioxidant, anti-inflammatory, hemostimulating and/or other important properties. The aim of the study was to identify possible antiviral activity of known IMD Glutoxim (GLT) during infection of diploid fibroblast cell lines M-8 and M-22 with vesicular stomatitis virus (VSV). Materials and methods: VSV, strain Indiana, was used. Antiviral activity of GLT investigated: 1) at doses recommended for experiments in vitro: 1, 4 and 8 µg/ml; 2) at low doses: 0,1; 0,25 and 0,5 µg/ml. GLT was added to the cell monolayer according to preventive (for 24 hours prior to VSV infection of cells) and treatment (unanimous with VSV infection) protocols. The antiviral activity of GLT was assessed by the following criteria: ability of the drug to prevent the development of virus cytopathic action, to inhibit the reproduction of VSV, and by expessing virucidal action. Results: GLT in doses recommended for in vitro experiments (1, 4, 8 µg/ml) did not delay the development of a specific virus-induced cytopathic action. The VSV titers in infected cells in the presence of GLT did not differ from those in the control cell lines infected with VSV without the addition of GLT. The latter had no virucidal effect against the VSV. Inoculation of GLT into the cell culture at low doses of 0.1, 0.25 and 0.5 mg/ml led to a significant (more than 100-fold) inhibition of VSV replication 24 hours after infection of cells. At later stages, 40 and 48 hours following infection, the antiviral effect of GLT was not detected. Thus, we established that GLT possesses antiviral effect in vitro, which is manifested 24 hours following infection of diploid fibroblast cell lines with VSV.
Glutoxim, vesicular stomatitis virus, immunomodulator, antiviral effect, fibroblast cell line, phosprenyl, interferon
Сокращения: ВВС ― вирус везикулярного стоматита, ГЛТ ― глутоксим, ИЛ ― интерлейкин, ИМД ― иммуномодулятор, ИФН ― интерферон, ЛДКФЧ ― линии диплоидных клеток фибробластов человека, ТЦД ― тканевая цитопатогенная доза, ФНО ― фактор некроза опухоли, ФП ― фоспренил, ЦПД ― цитопатогенное действие, ЦТ ― цитокины.
Введение
Основой новой стратегии лечения инфекционных заболеваний животных является модуляция иммунного ответа организма хозяина для усиления клиренса инфекционных агентов и уменьшения повреждающего действия процессов, связанных с воспалением в тканях. Современный подход к применению ИМД в ветеринарной практике предполагает преимущественное использование таких препаратов, которые помимо собственно иммуномодулирующей активности обладают, в частности, противовирусными, антиоксидантными, противовоспалительными, гемостимулирующими и/или иными важными свойствами. В связи с этим, актуальной задачей представляется поиск возможной противовирусной активности у ряда известных ИМД.
Цель исследования
Изучить противовирусное действие такого ИМД, как ГЛТ, разрешенного к клиническому применению в качестве противоинфекционного лекарственного средства [1, 2]. В качестве препарата сравнения использовали ФП, который представляет собой ИМД с противовирусным и противовоспалительным действием, широко используемый в ветеринарной практике [9, 11].
Материалы и методы
Вирус. Использовали ВВС, штамм Индиана, полученный из банка вирусов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. ВВС пассировали и титровали в ЛДКЧФ М-22 и М-8 и выражали в lg ТЦД50 [7].
ЛДКЧФ. Опыты проводили на ЛДКЧФ М-22 и М-8 из коллекции клеточных культур ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН».
ИМД. Препарат ГЛТ в виде стерильного, лиофилизированного порошка (ЗАО «Фарма ВАМ», Государственный завод медицинских препаратов ФГУП, Россия). Перед употреблением содержимое флакона растворяли в среде поддержки. Препарат ФП (ЗАО «Микро-плюс», серия №1213) разводили средой №199 на растворе Эрла рН=7,6 до концентрации 100 мкг/мл и наносили на монослой клеток. В качестве положительного контроля использовали коммерческий человеческий лейкоцитарный интерферон (производитель: «Биомед», Пермь, Россия) в дозе 100 МЕ/мл.
Испытание цитотоксического действия и противовирусной активности препаратов проводили на монослойной культуре клеток М-22 и М-8 с использованием 96-луночных планшет (фирмы «Costar», GB), которые инкубировали при 37о С и 5 % СО2.
Цитотоксическое действие препаратов на клетки определяли однократным внесением в культуру клеток М-22 и М-8: а) формирующую монослой, б) достигшую монослоя (24 ч). Токсичность определяли посредством световой микроскопии по степени изменения морфологии клеточного монослоя и контролировали в течение 96 ч.
Противовирусную активность ГЛТ оценивали по следующим критериям: предотвращение развития вирусного ЦПД, подавление репродукции ВВС в ЛДКФЧ, вирулицидное действие. Статистическую обработку проводили по Фишеру [6].
Результаты
Изучение токсичности ГЛТ в отношении клеток М-22 и М-8. Проведенные исследования показали, что в концентрациях 1, 4 и 8 мкг/мл препарат ГЛТ не замедляет клеточного роста и не вызывает видимых цитопатических изменений монослоя клеток М-22 и М-8. По данным теста с трипановым синим, процент жизнеспособных клеток, инкубированных в течение 96 ч в присутствии различных концентраций препарата ГЛТ, практически не отличался от такового у контрольных клеток. Полученные результаты полностью согласуются с данными о нетоксичности препарата ГЛТ в исследованных концентрациях для культур клеток [12].
Изучение вирулицидного действия ГЛТ. Независимо от использованной в опытах концентрации, после совместной инкубации с тест-вирусом при 37 о С в течение 1 ч в соотношении 1:1, препарат не влиял на внеклеточные вирионы и не снижал титр вируса, по сравнению с аналогичным показателем в контроле у вируса, находившегося в тех же условиях, но не обработанного ГЛТ.
Профилактическая схема применения ГЛТ на модели инфекции, вызванной ВВС in vitro. ГЛТ, внесенный в концентрациях 1, 4 и 8 мкг/мл за 24 ч до заражения не приводил к задержке развития вирусного ЦПД в лунках с множественностью заражения 0,1 – 0,01 ‒ 0,001 ЦПД50/клетку и не снижал титра вируса (табл. 1). Таким образом, ГЛТ не обладал противовирусным действием при его использовании по профилактической схеме.
Выявление противовирусной активности ГЛТ, использованного по лечебной схеме. ЛДКЧФ М-22 или М-8 инокулировали ГЛТ в концентрациях 1, 4, 8 мкг/мл в составе поддерживающей среды одновременно с заражением ВВС. Данные, представленные в таблице 1, показывают, что ГЛТ в данных дозах не подавляет размножение ВВС. Напротив, ФП снижал титр ВВС на 1,75 lg ТЦД50 по сравнению с контролем. Ежедневное (в течение 3-х суток) визуальное наблюдение за клетками, зараженными ВВС и обработанными ГЛТ, показало, что ГЛТ в указанных дозах не задерживал развитие вирус-индуцированного ЦПД в клетках. При этом титры вируса в инфицированных клетках в присутствии ГЛТ не отличались от таковых в контрольных ЛДКЧФ, инфицированных ВВС без добавления препарата.
1. Противовирусная активность препаратов ГЛТ и ФП в отношении вируса везикулярного стоматита в ЛДКЧФ М-22 и М-8
1. Antiviral activity of GLT and Phosprenyl against vesicular stomatitis virus in M-22 and M-8 cell lines
|
Препарат |
Профилактическая схема |
Лечебная схема
|
|
Титр / снижение титра, lg ТЦД50 |
||
|
ГЛТ, 1 мкг/мл |
4,5 / ‒ |
4,75 / ‒ |
|
ГЛТ, 4 мкг/мл |
4,5 / ‒ |
5,00 / ‒ |
|
ГЛТ, 8 мкг/мл |
4,5 / ‒ |
4,75 / ‒ |
|
ФП, 100 мкг/мл |
3,5 / 1,0 |
3,00 / 1,75 |
|
Интерферон, 100 МЕ |
0,00 / 4,5 |
0,00 / 4,75 |
|
Контроль вируса, lg ТЦД50 |
4,5 |
4,75 |
|
|
|
|
Выявление антивирусного действия ГЛТ в низких концентрациях. Нас заинтересовал вопрос о возможном противовирусном эффекте ГЛТ при обработке клеток дозами препарата ниже рекомендованных для опытов in vitro [1, 4]. В следующей серии экспериментов клетки линии М-22 были обработаны ГЛТ в концентрациях 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл в составе поддерживающей среды с последующим заражением ВВС (по лечебной схеме). Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что ГЛТ значительно подавляет развитие ЦПД ВВС в ЛДКФЧ: через 24 ч титры ВВС в контроле достигают 3,5 lg ТЦД50, а в клетках, обработанных ГЛТ в концентрациях 0,1; 0,25 и 0,5 мг/мл ― 1 lg ТЦД50, 1,75 lg ТЦД50 и 1,75 lg ТЦД50, соответственно. Таким образом, ГЛТ в минимальной дозе (0,1 мкг/мл) обладает способностью подавлять размножение ВВС в ЛДКФЧ более чем в 100 раз. Через 40 и 48 ч противовирусный эффект ГЛТ во всех использованных дозах не выявляется (см. табл. 2).
2. Влияние ГЛТ в низких концентрациях на размножение вируса везикулярного стоматита в клетках М-22
2. Effect of GLT in low doses on reproduction of vesicular stomatitis virus in M-22 cells
|
Доза ГЛТ, мкг/мл |
Титр после заражения / снижение титра, lg ТЦД50 |
||
|
через 24 ч |
через 40 ч |
через 48 ч |
|
|
0,1
|
1,00 /2,5 |
4,5 / ‒ |
5,0 / ‒ |
|
0,25 |
1,75 / 1,75 |
4,0 / ‒ |
4,75 / ‒ |
|
0,5 |
1,75 / 1,75 |
3,75 / 0,25 |
4,75 / ‒ |
|
Контроль вируса, lg ТЦД50 |
3,5 |
4,0 |
4,75 |
Обсуждение
ГЛТ является фармакологическим аналогом естественного метаболита ― окисленного глутатиона. Это химически синтезированный гексапептид (бис-(гамма-L- глутамил)-L-цистеинил-бис-глицин динатриевая соль), в котором искусственная стабилизация дисульфидной связи позволяет многократно усилить физиологические эффекты, присущие предшественнику ― естественному окисленному глутатиону. ГЛТ стимулирует каскадные механизмы фосфатной модификации основных белков сигнал-передающих систем, способствует синтезу цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО, ИФН, индуцирует экспрессию рецепторов ИЛ-2 [2]. Подобно ФП, ГЛТ оказывает иммуномодулирующее, гемостимулирующее, детоксицирующее, гепатопротекторное и антиоксидантное действие [2, 10, 12]. Препарат также стимулирует кальциевый сигнал в макрофагах [5, 8]. Иммуномодулирующие свойства ГЛТ и способность стимулировать продукцию эндогенных ИФН и других ключевых ЦТ обосновывают проведение исследований по выявлению его возможной антивирусной активности. Однако сведений о его противовирусном эффекте не имеется. Отсутствуют также данные о способности препарата усиливать действие средств противовирусной терапии.
Адекватной моделью для выявления антивирусной активности ИМД и изучения механизмов их действия являются ЛДКФЧ. Фибробласты рассматриваются как потенциально иммунорегуляторные клетки, функционально эквивалентные мезенхимальным стволовым клеткам [13]. ЛДКФЧ и первичные фибробласты широко используются для изучения молекулярных механизмов иммунопатогенеза вирусных инфекций и противовирусной активности ИМД [14]. ЛДКФЧ обладают способностью продуцировать ИФНы I типа и другие ЦТ; ВВС ― ИФН-чувствительный вирус, поэтому использование ВВС-инфекции ЛДКФЧ в качестве модели для выявления возможной антивирусной активности ГЛТ представляется адекватным. Данная модель была успешно использована нами при исследовании противовирусной и интерфероногенной активности различных ИМД, в том числе ФП [3].
В настоящей работе представлены данные о выявлении противовирусной активности ГЛТ при инфицировании ЛДКФЧ М-8 и М-22 вирусом везикулярного стоматита. В серии экспериментов с использованием ГЛТ в дозах 1, 4 и 8 мкг/мл нам не удалось выявить антивирусную активность препарата, использованного как по лечебной, так и по профилактической схеме. Иная картина наблюдается при обработке ЛДКФЧ ГЛТ в концентрациях 0,1; 0,25 и 0,5 мг/мл. Через 24 ч после инфицирования ЛДКФЧ М-22 ВВС регистрируется значительное (более чем в 100 раз) подавление репликации вируса под воздействием ГЛТ (см. табл. 2).
Обращает на себя внимание тот факт, что в работах по исследованию действия ГЛТ in vitro положительные результаты достигались при использовании достаточно высоких доз препарата: 1, 4, 8, 16, 32, 64 мкг/мл и выше [1, 4]. При этом не наблюдалось токсического эффекта ГЛТ при обработке препаратом макрофагов или нейтрофилов [4]. Напротив, мы показали, что ГЛТ в концентрациях 16 мкг/мл и выше проявлял токсичность в отношении ЛДКФЧ, что, по-видимому, объясняется различиями в чувствительности к препарату клеток разного происхождения. В нашей работе впервые показано, что ГЛТ обладает способностью подавлять размножение ВВС в ЛДКФЧ через 24 ч после заражения. Впервые установлено также, что на более поздних сроках (через 40 и 48 ч) после заражения клеток вирусом препарат ГЛТ не только не проявляет антивирусной активности, но и способствует усилению репродукции ВВС в культуре клеток. Поскольку ГЛТ обладает свойствами ИМД, в том числе стимулирует продукцию эндогенных ИФН, логично предположить, что противовирусный эффект препарата в отношении репродукции ВВС в ЛДКФЧ связан с его интерфероногенной активностью. Для проверки данного предположения мы проводим дальнейшие исследования иммуномодулирующих свойств ГЛТ в ЛДКФЧ.
Вывод
Впервые установлено, что ГЛТ обладает противовирусным действием in vitro, проявляющимся через 24 ч после заражения.
Конфликт интересов
Авторский коллектив не получал спонсорской помощи от производителей или поставщиков оборудования и расходных материалов, указанных в данной работе.
1. Vasil'eva, S.N. Eksperimental'noe obosnovanie ispol'zovaniya Glutoksima v kachestve sredstva soprovozhdeniya etiotropnoy terapii generalizovannogo tuberkuleza / S.N. Vasil'eva: avtoref. dis. … kand. med. nauk (zaschischena 14.03.2007), ― SPb.: NII ftiziopul'manologii, 2007. ― S 22.
2. Instrukciya po medicinskomu primeneniyu preparata Glutoksim; Patent RU N 2 498 821 C1. Rezhim dostupa: http://www.glutoxim.ru.
3. Konyushko, O.I., Ekspressiya genov interferonov v kul'ture fibroblastov cheloveka pri vozdeystvii immunomodulyatorov i pri virusnoy infekcii / O.I. Konyushko, S.V. Ozherelkov, E.V. Hitrina, A.V. Salichev, T.N. Kozhevnikova, A.V. Sanin // Molekulyarnaya medicina. ― 2016. ― T. 14. ― № 5. ―S. 43‒49.
4. Kunichan, A.D. Vliyanie glutoksima na rost lekarstvennoustoychivyh mikobakteriy tuberkuleza pri ego sochetanii s protivotuberkuleznymi preparatami vtorogo ryada v kul'ture legochnoy tkani myshey / A.D. Kunichan, G.B. Sokolova, M.I. Perel'man // Antibiotiki i Himioterapiya. ― 2002. ― T. 47. ― № 6. ― S. 18–21.
5. Kurilova, L.S. Vliyanie okislennogo glutationa i ego farmakologicheskogo analoga preparata Glutoksim na vnutrikletochnuyu koncentraciyu Sa2+ v makrofagah / L.S. Kurilova, Kruteckaya Z.I., Lebedev O.E., Antonov V.G. // Citologiya. ― 2008. ― T. 50. ― №5.― S. 452‒461.
6. Lakin, G.F. Biometriya. ― M: Vysshaya shkola, 1990. ― 352 s.
7. Lennet, E.H. Laboratornaya diagnostika virusnyh i rikketsioznyh zabolevaniy / E.H. Lennet, N. Shmidt. ― M.: Medicina, 1974. ― S. 42–46.
8. Naumova, A.A. Sigma-1 receptors are involved in modulation of Ca2+ responses induced by glutoxim and molixan in macrophages / A.A. Naumova, Z.I. Krutetskaya, L.S. Milenina, A.V. Melnitskaya, N.I. Krutetskaya, S.N. Butov, V.G. Antonov // The FEBS Journal. ― 2017. ― Vol. 284. ― suppl. 1. ― rr. 228‒229.
9. Sanin, A.V. Primenenie immunomodulyatorov pri virusnyh zabolevaniyah melkih domashnih zhivotnyh/ A.V. Sanin, A.N. Narovlyanskiy, A.V. Pronin // Veterinariya i kormlenie. ― 2017.― № 3. ― S. 95‒97.
10. Sanin, A.V. Izuchenie antioksidantnyh svoystv Fosprenila v razlichnyh biologicheskih test-sistemah / A.V. Sanin, A.N. Narovlyanskiy, A.V. Pronin, T.N. Kozhevnikova, V.Yu. Sanina, A.D. Agafonova // Rossiyskiy veterinarnyy zhurnal. ― 2017 ― № 10 ― S. 28‒31.
11. Sanin, A.V. Issledovanie protivovospalitel'noy aktivnosti fosprenila v eksperimente / A.V. Sanin, S.A. Suhanova, O.V. Proskurina, N.M. Mitrohin, I.V. Ganshina, G.F. Sud'ina, V.Yu. Sanina, A.A. Videnina, T.N. Kozhevnikova, A.A. Sanin, S.V. Ozherelkov, A.V. Salichev, A.V. Pronin, A.N. Narovlyanskiy // Rossiyskiy veterinarnyy zhurnal, MDZh. ― 2011. ― № 4. ― S. 17‒20.
12. Easton, D.M. Potential of immunomodulatory host defense peptides as novel anti-infectives / D.M. Easton, A. Nijnik, M.L. Mayer, R.E.W. Hancock // Trends in Biotechnology. ― 2009. ― Vol. 27. ― No. 10. ― pp. 582‒590.
13. Haniffa, M. Adult Human Fibroblasts Are Potent Immunoregulatory Cells and Functionally Equivalent to Mesenchimal Stem Cells / M. Haniffa, AXiao-nong Wang, U. Holtick, R. Michelle, J.D. Isaacs, A.M. Dickinson, M.U.C. Hilkens, M.P. Collin // The Journal of Immunology. ― 2007. ― No. 179. ― pp. 1595‒1604.
14. Fang Li. Antiviral Effect of IDO in Mouse Fibroblast Cells During Influenza Virus Infection / Fang Li Håkan Karlsson // Viral Immunology. ― 2017. ― No. 30 (7) ― pp. 542‒544.
