Hanoy, Vietnam
Hanoy, Vietnam
Hanoy, Vietnam
Hanoy, Vietnam
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
The Food Industries Research Institute of Vietnam is one of the leading research institutes in the country, which study the use of microorganisms in food production. One of the main goals of the Institute is to collect and search for new strains for further research and production. Recently, the Institute has focused on products that use biomasses of microorganisms, such as zinc- and selenium-forified yeast biomass. The present research features new yeast strains for the production of high-zinc-containing preparations. The studies examined the properties of Saccharomyces cerevisiae A112 and its stability under laboratory conditions. The research was conducted at the Food Industries Research Institute of Vietnam. The Saccharomyces cerevisiae A112 was found to contain up to 12.88 mg of zinc per gram of dry biomass when 1 g/l sulfate salt was added to the medium. The results allowed for industrial use of zinc-enriched yeast biomass. The new strain is resistant to temperatures up to 35°C while the optimal growth temperature is 28–33°C.
Zinc-fortified biomass, high-zinc-containing preparations, yeast, Saccharomyces cerevisiae, zinc
Введение
Цинк очень важен для организма, как и другие микроэлементы и витамины. Он обладает ранозаживляющими свойствами. Он нужен для организма, так как в нем нуждаются все ткани и органы человека. Цинк жизненно необходим для развития репродуктивной системы, нормализации гормонального фона, укрепления иммунитета и регенерации. Цинк можно найти в составе более 300 ферментов, в том числе тех, которые участвуют в синтезе ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), сложных эфиров, белков и жиров [1]. Цинк участвует практически во всех стадиях роста клеток. Особый интерес к цинку связан с открытием его роли в нуклеиновом обмене, процессах транскрипции, стабилизации нуклеиновых кислот, белков и особенно компонентов биологических мембран, а также в обмене витамина А [2].
Цинк относится к важным и незаменимым для жизнедеятельности организма человека микроэлементам. Уровень потребления цинка в различных странах варьируется в довольно широких пределах – от 5,5 до 17,4 мг/сут [3]. Для взрослого мужчины рекомендуемая доза применения цинка составляет 15 мг, для детей – 5–10 мг в день, для беременных женщин – около 15 мг в сутки [4].
Недостаток цинка вызывает функциональные и морфологические изменения в деятельности органов и систем [5]. При недостатке цинка будет наблюдаться: снижение аппетита, анемия, аллергические заболевания, частые простуды, дерматиты, снижение массы тела и остроты зрения, а также выпадение волос. Данный элемент увеличивает уровень тестостерона, но при его недостатке будет происходить задержка полового развития мальчиков и потеря активности сперматозоидов для оплодотворения яйцеклетки. Также при недостаточном количестве цинка очень плохо заживают раны и долго восстанавливаются ткани после травм.
Недостаточность микроэлементов часто реги- стрируется в раннем детстве, когда потребность организма в них особенно высока, а пища не всегда содержит их в достаточном количестве. У
70 % детей до 6 лет есть необходимость введе- ния цинка для укрепления иммунитета, костной ткани (особенно у детей, которые не получали грудного кормления). Дети 6–14 лет имеют дефицит в 50 % случаев. У подростков 14–18 лет чаще всего наблюдается дефицит кальция (40 %), магния (50 %) и цинка (30 %) [6].
Главным источником цинка являются зерновые, однако, при их очистке от отрубей содержание цинка значительно снижается. Обогащение цинком пищевых продуктов и полуфабрикатов является актуальной проблемой [7], для решения которой предложен ряд биодобавок. В частности, зарегист- рированы пивные дрожжи, обогащенные цинком [3]. Биомасса дрожжей в современной био- технологии считается источником белка, сбалансированного по незаменимым амино-
кислотам. Биомасса дрожжей является источником белка, витаминов, липидов и других ценных веществ. Дрожжевая биомасса содержит около 44–45 % белка, 25–35 % углеводов, липиды составляют около 1,5–5 %, минералы около 6–12 %. Это доказывает, что пищевая ценность дрожжевой биомассы очень велика. Кроме аминокислот, в дрожжевой биомассе содержится большое количество витаминов группы В [8].
Дрожжи обладают способностью накапливать металлы (Pb, Hg, Cr, Mn, Cu, Zn, Cd и т.д.) в клетках при различных уровнях роста в присутствии этих металлов. Металлы Cu, Zn и Mn оказывают положительное влияние на активность дыхания и темпы роста дрожжей [15]. Большинство видов дрожжей имеет способность накапливать цинк в их биомассе при культивировании с добавлением солей цинка. Но количество цинка, содержащееся в дрожжевой биомассе, различно для разных видов и штаммов дрожжей. Поэтому значительный интерес для дальнейших исследований представляет поиск и изучение новых штаммов, которые способны содержать большое количество цинка в их биомассе. Целью данной работы является изучение в деталях нового штамма S. cerevisiae A112, который выделен из земли во Вьетнаме, для получения
высоко-цинкосодержащих препаратов.
Объекты и методы исследования
Основным объектом является штамм Saccharomyces cerevisiae A112, выделенный из земли, которая собрана в зоне Шонг Конг города Тхай Нгуен Вьетнама. В качестве контрольного штамма, используемого в пищевой промышленности, был выбран штамм S. cerevisiae CNTP 4087 из коллекции центра промышленных микроорганизмов в Научно-исследовательском институте пищевой промышленности (Вьетнам). Указанный штамм обладает способностью эффективно утилизировать моно-, ди- и трисахариды с образованием этилового спирта. Штамм S. cerevisiae CNTP 4087 является типичным штаммом, использующимся для получения цинксодержащих препаратов [9].
Для изучения соотношения штамма S. cerevisiae A112 к различным источникам углеводов использовали ID-32C (Германия) – систему для идентификации дрожжевых грибов.
Тестирования на устойчивость к температуре проводили путем переноса 1 мл культуры дрожжей с помощью пипетки на твердую среду в чашках и инкубировали при различных температурах в течения 48 часов [10].
Для изучения способности обогащения цинком в биомассе пекарские дрожжи выращивали на питательной среде следующего состава (опытный вариант): вода дистиллированная –
1 л; глюкоза – 100 г/л; дрожжевой экстракт
- 3 г/л; пептон – 5 г/л; солодовой экстракт –
3 г/л, в который добавили соль цинка (сульфат цинка) с различными концентрациями соли:
Khanh N.T.M. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2018, vol. 48, no. 4, pp. 114–120
Рисунок 1 – Морфология роста колоний штамма
S. cerevisiae A112 и микроскопическая картина отдельно взятых колоний при световой микроскопии
Figure 1 – The morphology of the growth of colonies of S. cerevisiae A112 strain and the microscopic picture of individual colonies under light microscopy
0,25; 0,5; 1; 1,5; 2,0 г/л. Контрольная среда содержала: вода дистиллированная – 1 л; глюкоза
- 100 г/л; дрожжевой экстракт – 3 г/л; пептон – 5 г/л; солодовой экстракт – 3 г/л. Культивирование проводили в шейкере со скоростью 150 об/мин, при температуре 28 °С и в течение 48 часов.
Для получения сухой биомассы она была высушена при температуре 60 °С в течение
2 часов, потом выдержана при температуре 105 °С до постоянной массы [4]. Биомасса клеток измеряется в граммах сухих веществ/л.
|
H O и разрушили данный образ СВЧ-печью. Далее,
анализировали содержание цинка (длина волны 213,9 нм) [11].
Результаты и их обсуждение
Морфологические признаки. Клетки нового штамма S. cerevisiae A112 имеют типичную форму и размер. Клетки круглые, кругло-овальные, размером 5,0–8,8 мкм. Колонии на солодовом сусло-агаре матовые, гладкие, консистенция пастообразная, цвет кремовый, форма круглая, край ровный, профиль конусообразный, внутренний узор однородный (рис. 1).
В жидком солодовом сусле формируется плотный осадок, кольцо и пленку не образует. Размножается почкованием.
Отношение к источникам углеводов. Для определения видовой принадлежности штамма
S. cerevisiae A112 использовали ID-32C (Германия)
- система для идентификации дрожжевых грибов. Полоска (стрип) ID-32C состоит из 32 лунок, содержащих высушенные субстраты, которые позволяют провести 30 ассимиляционных тестов. Лунки заливали полужидкой минимальной средой. Рост дрожжей в лунке свидетельствует о том, что они способны использовать тот или иной субстрат в качестве единственного источника углерода. Реакции учитывали путем сравнения характера роста с контролем через 24, 48, 96 ч (табл. 1).
Установлено, что дрожжи S. cerevisiae A112 утилизировали глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, Глицерин, D-Маннит, Раффинозу. Отрицательные результаты теста были выявлены на: D-глюкозамине, D-ксилозе, L-арабинозе, D-сорбите, Лактозе, 2-кето-D-Глюконате, Цитрате железа.
Устойчивость к температуре. Устойчивость к повышенной и пониженной температуре является
одной из важнейших характеристик штамма,
2 2
налили дистиллированную воду в колбу с образцом
|
которая может быть в дальнейшем использована в технологическом процессе. Мы изучали устойчивость к температуре нового штамма
S. cerevisiae A112 по сравнению с контрольным
Таблица 1 – Отношение к источникам углеводов штамма S. cerevisiae A112
Table 1 – S. cerevisiae A112 and sources of carbohydrate
|
№ |
Источники углеводов |
Результаты |
|
№ |
Источники углеводов |
Результаты |
|
1 |
D-Глюкоза |
+++ |
|
16 |
Раффиноза |
++ |
|
2 |
D-галактоза |
+ |
|
17 |
Мелезитоза |
– |
|
3 |
L-сорбоза |
+ |
|
18 |
Глицерин |
++ |
|
4 |
D-глюкозамин |
– |
|
19 |
Эритритол |
+ |
|
5 |
Палатиноза |
++ |
|
20 |
D-Маннит |
++ |
|
6 |
D-ксилоза |
– |
|
21 |
Мио-инозитол, |
– |
|
7 |
L-арабинозы |
– |
|
22 |
2-кето-D-Глюконат |
– |
|
8 |
L-рамнозы |
+ |
|
23 |
Молочная кислота |
+ |
|
9 |
Сахароза |
++ |
|
24 |
D-Глюконат |
+ |
|
10 |
Мальтоза |
++ |
|
25 |
Циклогексимид |
+ |
|
11 |
α, α-трегалоза |
+ |
|
26 |
Глюконат Натрия |
+ |
|
12 |
D-сорбит |
– |
|
27 |
Метил α, D-глюкопиранозид |
+ |
|
13 |
Целлобиоза |
– |
|
28 |
Левулиновая кислота |
+ |
|
14 |
Мелибиоза |
+ |
|
29 |
Цитрат железа (ESGulin) |
– |
|
15 |
Лактоза |
– |
|
30 |
Рафинозы |
– |
Кхань Н. Т. М. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2018. Т. 48. № 4 С. 114–120
|
0 0,25 0,5 1 1,5 2 |
|
Содержания Zn2+ в сухой биомассе дрожжей (мг/г) |
Таблица 2 – Устойчивость нового штамма S. cerevisiae 20 12
A112 к температуре
Table 2 – S. cerevisiae A112 and its resistance to temperature
15 9
|
5 3
0 0
Концентрации сульфата цинка в питательной среде (г/л)
штаммом S. cerevisiae CNTP 4087. Установлено, что новый штамм S. cerevisiae A112 более устойчив
Содержания Zn2+ в сухой биомассе дрожжей Средний выход сухих дрожжей биомассы
к повышенной температуре (таб. 2). Оптимальная температура роста принадлежит диапазону: от 28 °С до 33 °С. Устойчивость к повышенной температуре производственного штамма можно использовать, повышая температуру брожения. Использование высокотемпературных дрожжей может ускорить ферментацию, снизить риск микробного загрязнения, снизить уровень кислорода, других газов и т. д. [12]. Кроме этого, инвестиционные затраты на охлаждающее оборудование являются экономически выгодными [13,14].
Способность к обогащению цинком биомассы. Для выбора концентрации сульфата цинка новый штамм культивировали в средах с различными концентрациями соли: 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2 г/л. Образцы культивировали в течение 48 часов при температуре 28 °С. Мы выявили, что на рост и количество цинка, содержащегося в биомассе, сильно влияет количество соли (рис. 2). При использовании сульфата цинка в малых концентрациях (0,25 и 0,5 г/л) он незначительно влияет на выход сухой дрожжевой биомассы. Но когда количество соли цинка увеличивается до 1 и 1,5 г/л, выход дрожжевой биомассы начинает уменьшаться в сравнении с контрольным образцом. После добавления 1,5 г/л соли цинка и 48 часов культивирования, получили сухую биомассу 7,8 г/л, что в 1,5 раз меньше, чем в контрольном образце (без добавления сульфата соли). В концентрации
2 г/л соли сульфата биомасса снижается до 0,8 г/л. Это явление можно объяснить тем, что большое количество сульфата цинка уже является отрицательным фактором, который прямо влияет на жизнеспособность дрожжевых клеток. Этот результат соответствует исследованиям авторов К. А. Шомаиех и коллег.
Концентрация соли цинка также сильно влияет на содержание цинка в дрожжевой биомассе. Чем больше количество сульфата цинка добавляется в среду, тем больше количество цинка содержится в биомассе. После 48 часов культивирования содержание цинка в биомассе достигало 15,95 мг/г при добавлении 2 г/л сульфата цинка и в культивированной среде.
Рисунок 2 – Влияние концентрации сульфата цинка на выход биомассы и содержание цинка в дрожжевой биомассе штамма S. cerevisiae A112
Figure 2 – The effect of zinc sulphate concentration on biomass yield and zinc content in S. cerevisiae A112 yeast biomass
Результаты исследования выявили, что для получения большого количества выхода биомассы с большим количеством содержания цинка нужно выбрать концентрацию сульфата цинка 1 г/л.
Стабильность нового штамма S. cerevisiae A112 при культивировании в биореакторе объема 20Л Solaris (Италия). Культуру штамма S. cerevisiae CNTP 4087 и S. cerevisiae A112 культивировали в биореакторе при одних и тех же условиях: при температуре 28 °С в течение 48 часов с добавлением 1 г/л сульфата цинка и со скоростью перемешивания 150 об/мин.
Результаты показывают, что при куль- тивировании в биореакторе 20Л оба штамма хорошо развивались. Самый большой выход биомассы после 48 часов культивирования достигал 10,6 г/л для штамма S. cerevisiae CNTP 4087 и 13,0 г/л для штамма S. cerevisiae A112. Выход
|
Средний выход сухой дрожжевой биомассы (г/л) |
12
8
4
0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Время культивирования (час)
CNTP 4087 A112
Рисунок 3 – Выход дрожжевой биомассы штаммов
S. cerevisiae CNTP 4087 и S. cerevisiae A112 при культивировании в биореакторе 20Л
Figure 3 – Yeast biomass yield of S. cerevisiae CNTP 4087
and S. cerevisiae A112 strains when cultured in a 20-litre bioreactor
Khanh N.T.M. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2018, vol. 48, no. 4, pp. 114–120
|
0 6 12 18 24 32 38 42 48 |
|
Содержание Zn2+ в сухой биомассе дрожжей (мг/кг) |
14 следует, что данный штамм способен эффективно утилизировать моно-, ди- и трисахариды. Hовый
12 штамм S. cerevisiae A112 устойчив к повышенной
10 температуре. Оптимальная температура роста принадлежит диапазону от 28 °С до 33 °С.
8 Биомасса штамма S. cerevisiae A112 обладает
6 способностью адсорбировать цинк. Чем большее количество соли цинка добавляется в
4 питательную среду, тем большее количество
2 цинка содержится в биомассе. Когда концентрация
0 сульфата цинка в питательной среде меньше 1 г/л он незначительно влияет на выход дрожжевой
|
Время культивирования (час) |
|
S. cerevisiae CNTP 4087 |
|
S. cerevisiae A112 |
биомассы. Концентрация сульфата цинка более
|
|
Рисунок 4 – Содержание цинка в сухой биомассе дрожжей при культивировании в биореакторе объема 20Л
Figure 4 – Zinc content in dry yeast biomass when cultivated in a
20-litre bioreactor
биомассы у нового штамма A112 даже лучше, чем у контрольного штамма S. cerevisiae CNTP 4087.
Далее мы рассмотрели, как содержание цинка в биомассе дрожжей изменяется при культивировании в биореакторе в течение 48 часов. Немного различий между полученными количествами цинка в биомассе штаммов S. cerevisiae CNTP 4087 и
S. cerevisiae A112 при культивировании в биореакторе 20Л. Самое большое количество цинка в биомассе получено 9,35 мг/г для
- cerevisiae CNTP 4087 и 12,88 мг/г для S. cerevisiae
A112.
Выводы
По результатам изучения некоторых типичных свойств нового штамма S. cerevisiae A112
20Л новый штамм S. cerevisiae A112 показал, что он стабильный в культивируемых условиях. Поэтому его возможно использовать в производстве в промышленном масштабом.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
Благодарности
Выражаем благодарность и глубокую признательность всем сотрудникам Центра промышленной биохимии и экологии НИИ пищевой промышленности за помощь и советы при работе над данной статьей.
Финансирование
Материалы подготовлены в рамках выполнения научных исследований, осуществляемых НИИ пищевой промышленности в соответствии с Вьетнамским государственным заданием № DTDL CN-59/15
1. De Nicola R. and Walker G. Interaction between Yeasts and Zinc. In: Satyanarayana T. and Kunze G. (eds) Yeast Biotechology: Diveristy and Applications. Dordrecht: Springer Publ., 2008, pp. 237–257. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4020- 8292-4_12.
2. Kohrle J., Brigelius-Flohe R., Block A., et al. Selenium in biology: Facts and medical perspectives. Biological Chemistry, 2000, vol. 381, no. 9–10, pp. 849–864. DOI: https://doi.org/10.1515/BC.2000.107.
3. Budko E.V., Konoplya A.I., Khabarov A.A., Gorbacheva L.A., and Elʹtsova N.O. Obogashchenie drozhzhey solyami tsinka [Fortification of yeast with zinc salts]. Scientific bulletins of Belgorod State University. Series: Medicine. Pharmacia, 2012, vol. 129, no. 10–3, pp. 90–93. (In Russ.).
4. Azad S.K., Shariatmadari F., and Torshizi M.A.K. Production of zinc-enriched biomass of Saccharomyces cerevisiae.Journal of Elementology, 2014, vol. 10, no. 2, pp. 313–326. DOI: https://doi.org/10.5601/jelem.2014.19.2.655.
5. Magonet E., Hayen P., Delforge D., Delaive E., and Remacle J. Importance of the structural zinc atom for the stability ofyeast alcohol dehydrogenase. Biochemical Journal, 1992, vol. 287, no. 2, pp. 361–365. DOI: https://doi.org/10.1042/bj2870361.
6. Rustembekova S.A. Ehlementnyy portret cheloveka – zolotoy standart diagnostiki [Elemental portrait of a human as the gold standard for diagnosis]. Naturalʹnaya farmakologiya i kosmetologiya [Natural pharmacology and cosmetology], 2006, no. 3. (In Russ.).
7. Kodentsova V.M., Vrzhesinskaya O.A., Spirichev V.B., and Shatnyuk L.N. Substantation of vitamins and minerals level in fortified foodstuffs. Problems of Nutrition, 2010, vol. 79, no. 1, pp. 22 – 33. (In Russ.).
8. Phẩm N.Đ. Nấm men công nghiệp. Hànội: NXB Khoa học và kỹ thuật Publ., 2009. pp. 46–52.
9. Thành V.N. Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm. Hànội: Viện Công nghiệp thực phẩm Publ., 2012. pp. 57–64.
10. Davydenko S.G., Afonin D.V., Batashov B.E., et al. A new yeast strain for brewery: Properties and advantages. Russian Journal of Genetics, 2010, vol. 46, no. 11, pp. 1437–1484. (In Russ.).
11. Shet A.R., Patil L.R., Hombalimath V.S., Yaraguppi D.A., and Udapudi B.B. Enrichment of Saccharomyces cerevisiae with zinc and their impact on cell growth. Journal of Biotechnology, Bioinformatics and Bioengineering, 2011, vol. 1, no. 4, pp. 523–527.
12. Roehr M. The Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications. Weicheim: Wiley-VCH Publ., 2001. 244 p.
13. Limtong S., Sringiew C., and Yongmanitchai W. Production of fuel ethanol at high temperature from sugar cane juice by a newly isolated Kluyveromyces marxianus. Bioresources Technology, 2007, vol. 98, no. 17, pp. 3367–3374. DOI: https://doi. org/10.1016/j.biortech.2006.10.044.
14. Abdel-Banat B.M.A., Hoshida H., Ano A., Nonklang S., and Akada R. High-temperature fermentation: How can processes for ethanlo production at high temperatures become superior to the tranditional process using mesophilic yeast. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, vol. 85, no. 4, pp. 861–867. DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-009-2248-5.
15. Hà N.T., Hồng T.T., Nhàn N.T.T., Vân Đ.T.C., and Yến L.T.T. Nghiên cứ khả năng hấp thu một số kim loại nặng (Cu2+, Pb2+, Zn2+) trong nước của nấm men Saccharomyces cerevisiae. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 2007, vol. 23, no. 2, pp. 99–106.
