Формирование современными доказательными исследованиями фенотипов бронхиальной астмы (БА),
дифференцируемых по клиническим проявлениям, ведущему триггеру и характеру воспаления дыхательных
путей, существенно расширило представления о гетерогенности природы заболевания, позволив разработать
ряд безопасных и высокоэффективных средств терапии [2, 7, 16, 19, 20]. Несмотря на внедрение предлагаемых
новых фармакологических программ, в условиях реальной клинической практики сохраняется возможность
терапевтических неудач и трудности достижения хорошего контроля болезни [11, 14, 15]. В этой связи остаётся
актуальной в аспекте прогноза течения заболевания проблема воспаления дыхательных путей со свойственной
ему манифестацией не только на локальном, но и на системном уровне.
В работах по диагностическому значению морфологического фенотипирования БА нейтрофильный
фенотип считается наиболее присущим во время обострения болезни, тогда как период ремиссии ассоциируется
с эозинофильным воспалительным фенотипом, сопровождающим хороший ответ пациентов на лечение
ингаляционными глюкокортикостероидами (ИГКС) и анти-IL-5 препаратами [7]. Согласно данным ряда
исследований, посвящённых клинико-морфологической концепции холодовой гиперреактивности дыхательных
путей (ХГДП), нейтрофилия бронхиального инфильтрата при БА является фактором инициации и нарастания
резистентности к ИГКС. В условиях нейтрофилии происходит усугубление воспалительной реакции в бронхах
и, как следствие, клинических проявлений астмы, снижается уровень контроля над болезнью, отмечается
ухудшение проходимости дыхательных путей и увеличение частоты развития реакции бронхов на холодовой
стимул [3, 5]. Между тем, оба звена популяции гранулярных лейкоцитов – как нейтрофилы, так и эозинофилы –
в равной степени рассматриваются в роли эффекторов базисных явлений патогенеза БА – воспаления и
оксидативного стресса. Гранулоциты генерируют окислительные процессы, продуцируют активные формы
кислорода и свободные радикалы, синтезируют и активируют провоспалительные медиаторы, участвуя
посредством синергических и антагонистических взаимодействий Тh2 и Тh1 типов цитокинов в регуляции
ответа бронхов на триггер [10].
Определённый интерес представляет проблема взаимоотношений локального и системного
эозинофильного воспаления у больных БА, с большой вероятностью подвергающегося изменениям при холод-
индуцированном бронхоспазме, с клиническими и патофизиологическими параметрами болезни. Предстоит
оценить возможность влияния статуса эозинофилов в бронхах и крови на течение БА у больных с ХГДП, в том
числе, диагностическую и прогностическую ценность генерализации воспалительного пула эозинофилов.
Целью настоящей работы явилась комплексная характеристика эозинофильного звена воспаления во
взаимосвязи с клинико-функциональными показателями болезни у больных БА при холод-индуцированном
3
бронхоспазме.
Материалы и методы исследования
Проведено клинико-функциональное обследование 94 больных (средний возраст 39,9±1,2 лет), обоего
пола (46 мужчин, 48 женщин) с диагнозом персистирующей БА лёгкого и среднетяжёлого течения, согласно
критериям GINA [12].
Клиническое исследование выполнено с учетом требований Хельсинкской декларации «Этические
принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов» с поправкой 2013 г.,
и нормативных документов «Правила надлежащей клинической практики в Российской Федерации»,
утвержденных Приказом №200н от 01.04.2016 МЗ РФ. Все пациенты подписывали информированное согласие
на участие в исследовании в соответствии с протоколом, одобренным локальным Комитетом по
биомедицинской этике Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания (протокол №120/1
от 25.10.17).
Уровень контроля астмы, согласно опроснику Asthma Control Test (ACT, Quality Metric Inc., 2002) перед
началом исследования составил 17,5±0,6 баллов, объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ 1 ) –
95,6±1,8%. Из общего числа обследованных только одна треть больных систематически получала стандартную
терапию низкими дозами ИГКС (≤500 мкг/сутки по беклометазону дипропионату), у двух третей больных
лечение носило несистематический характер, либо отсутствовало.
Дизайном исследования предусматривалось мониторирование клинических симптомов астмы;
исследование функции внешнего дыхания с анализом кривой поток–объем форсированного выдоха на аппарате
Easy on-PC (nddMedizintechnik AG, Швейцария) с оценкой динамики ОФВ 1 (ΔОФВ 1БЛ , в %) на введение 4 доз β 2 -
агониста (сальбутамол, 100 мг); выявление реакции дыхательных путей (ΔОФВ 1ИГХВ , в %) на холодовой стимул
путём проведения стандартной 3-минутной изокапнической гипервентиляции холодным (-20ºС) воздухом
(ИГХВ) [6]. Больным осуществлялся сбор образцов индуцированной мокроты (ИМ) по стандартной методике
под спирометрическим контролем [9], сбор спонтанно продуцируемой мокроты после проведения пробы
ИГХВ. Цитологическое исследование мокроты выполнялось не позднее 2 часов после её получения по
стандартной методике, при помощи светооптической иммерсионной микроскопии с подсчётом не менее 400
клеток в 100 полях зрения в центральных и периферических частях препарата. Подсчитанное число клеток
выражали в процентах. В утренние часы выполнялся забор периферической крови из пальца с целью
определения абсолютного (в расчёте на 1 мкл крови) и относительного (при подсчете на 100 клеток, в
процентах) количества эозинофилов.
Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов
вариационной статистики. Для определения уровня статистической значимости различий использовали
параметрический критерий (t) Стьюдента (парный, непарный), в случаях негауссовых распределений –
непараметрический критерий Колмогорова-Смирнова, парный критерий Уилкоксона. С целью определения
степени связи между двумя случайными величинами проводили корреляционный анализ, рассчитывали
коэффициент корреляции (r). Для всех величин принимался во внимание минимальный уровень значимости (р)
0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
По результатам анализа базовых значений клеточного состава ИМ в общей группе больных БА
обнаружено повышенное процентное содержание эозинофилов и нейтрофилов (в среднем 9,8±1,07 и
48,9±1,53%, соответственно) (рис. 1). Кратковременное воздействие холодового триггера приводило к
достоверному увеличению содержания этих клеток в мокроте (13,3±1,0%, р=0,011; 52,8±1,36%, р=0,022,
соответственно). Кроме того, в ответ на пробу ИГХВ наблюдалось значимое усиление цитоза с 2,48±0,25 до
3,13±0,32% (р=0,0008).
0102030405060
нейтрофилы
эозинофилы
макрофаги
исходно
после пробы ИГХВ
%
р=0,00001
р=0,022
р=0,011
4
Рис. 1. Динамика показателей клеточного состава мокроты до и после пробы ИГХВ в общей группе
больных БА
Для того чтобы оценить характер клеточных изменений в мокроте у лиц с разными типами реакции на
холодовой стимул, больные были объединены в 1 группу (33 больных) с ХГДП и 2 группу (61 больной) без
признаков ХГДП (ΔОФВ 1ИГХВ =-18,4±1,3 и -2,2±0,6%, соответственно; р=0,00000001).
При анализе исходных цитограмм у больных исследуемых групп прослеживались явления цитоза со
статистически достоверным преобладанием его в мокроте пациентов 1 группы по отношению ко 2 группе
(3,4±0,68 и 2,1±0,13%, соответственно; р=0,02), в ответ на холодовую бронхопровокацию цитоз значимо
увеличивался только у лиц 2 группы (3,3±0,35 и 3,13±0,32%, соответственно; р=0,0002). Со стороны
гранулоцитов и в 1, и во 2 группах прослеживались те же тенденции, что и в общей группе больных:
воздействие холодного воздуха приводило к росту содержания этих эффекторных клеток в бронхиальном
секрете (рис. 2).
нейтрофилыэозинофилы макрофаги
0
10
20
30
40
50
60
1 группа исходно
1 группа после ИГХВ
2 группа исходно
2 группа после ИГХВ
р=0,003
р=0,031
р=0,015
р=0,041
р=0,024
%
Рис. 2. Динамика показателей клеточного состава мокроты до и после пробы ИГХВ у больных 1 и 2
группы (р – парный критерий Уилкоксона).
5
Частота 0 8 2 5 1 1 0 3 2 0 1 1 2 0 0 0 0 1 3 1 0 1
8 █
█
7 █
█
6 █
█
5 █ █
█ █
4 █ █
█ █
3 █ █ █ █
█ █ █ █
2 █ █ █ █ █ █ █
█ █ █ █ █ █ █
1 █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █
█ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █
----------------------------------------------------------------------------
Эоз им 1.20 7.44 13.68 19.92 26.16 32.40
Частота 0 23 14 3 1 5 1 1 1 2 2 2 0 1 1 0 1 1 0 0 1 0
22 █
20 █
18 █
16 █
14 █ █
12 █ █
10 █ █
8 █ █
6 █ █
4 █ █ █
2 █ █ █ █ █ █ █
----------------------------------------------------------------------------
Эоз им 1.00 9.88 18.76 27.64 36.52 45.40
Рис. 3. Частота встречаемости эозинофилов в мокроте у больных 1 (верхняя гистограмма) и 2 групп
(нижняя гистограмма).
Средние значения базового содержания эозинофилов в дыхательных путях, как в общей группе, так и
при разделении пациентов по реакции на пробу ИГХВ, указывали на принадлежность воспалительного
паттерна большинства больных к эозинофильному (≥2% эозинофилов в клеточном составе мокроты) [10].
Менее 2% эозинофилов в мокроте присутствовало лишь у 19% больных 1 группы и у 15% больных 2 группы
(χ 2 =0,25; р>0,05) (рис. 3), после пробы ИГХВ у этих больных (за исключением 3 больных 1 группы и 4 больных
2 группы) наблюдалось увеличение содержания эозинофилов в мокроте более 2%. В обеих группах воздействие
холода приводило также к увеличению в мокроте нейтрофилов при относительном уменьшении числа
макрофагов. Увеличение количества гранулоцитов мокроты по окончании пробы ИГХВ рассматривалось нами
как свидетельство холод-индуцированной стимуляции локального воспаления в бронхах.
Отсутствие статистически достоверных межгрупповых различий в структурном ответе эозинофильного и
нейтрофильного сегментов инфильтрата бронхов, скорее всего, было вызвано тем, что у 48% больных 1 группы
и 66% больных 2 группы (χ 2 =1,95; р>0,05) противовоспалительное лечение носило бессистемный характер,
либо отсутствовало, а у больных, получавших терапию, не приводило к адекватной коррекции воспаления и
предполагаемому протективному противовоспалительному эффекту, являясь недостаточным в осуществлении
дифференцированного подхода, учитывающего тип бронхиальной гиперреактивности. Эскалация
эозинофильного и нейтрофильного воспаления у пациентов с отсутствием ХГДП, не получавших эффективную
терапию на этапах, предшествующих исследованию, обусловила фактическое уравнивание воспалительных
статусов бронхов больных с различными типами реакции дыхательных путей на ИГХВ.
По итогам холодовой бронхопровокационной пробы нами не обнаружены отличия в показателях
гранулоцитарного звена воспаления дыхательных путей между пациентами 1 и 2 групп, что не исключает
поиска этих различий в дальнейшем, при более углублённом исследовании воспалительного профиля
бронхиального секрета в сочетании с изучением воспалительных реакций крови. Ввиду неконтролируемого
течения астмы, исследуемые больные, в большинстве своём, имели эозинофильный характер воспаления
бронхов, в отличие от смешанного, который мы наблюдали у больных тяжелой неконтролируемой БА с ХГДП.
Смешанный фенотип характеризуется морфофункциональной активацией нейтрофилов, ассоциируется с
прогрессированием симптомов болезни и нарушений вентиляционной функции лёгких [4]. Ранее нами было
6
показано, что у лиц с высоким содержанием нейтрофилов в мокроте увеличение числа эозинофилов значимо
влияло на проходимость дыхательных путей и величину реакции бронхов после ингаляции бронхолитика, что
приводило к потере контроля БА [3, 5]. Однако сопоставление данных цитограмм с клинико-функциональными
параметрами в настоящем исследовании выявило некоторую диссоциацию: превалирующий эозинофильный
тип воспаления не был предопределяющим в развитии и приумножении реакции бронхов на ИГХВ, а скорее
был сопряжён с ухудшением клинических и патофизиологических проявлений астмы, ассоциированной с
ХГДП.
Присутствие ХГДП у больных 1 группы, по сравнению со 2 группой, утяжеляло течение болезни, что
характеризовалось достоверно более низкими показателями контроля над заболеванием, по данным вопросника
АСТ, более значимыми нарушениями проходимости дистальных бронхов и высоким приростом ОФВ 1 в ответ
на пробу с бронхолитиком (табл. 1). Как было показано нами ранее, больные БА с ХГДП имеют трудности в
достижении контроля над заболеванием, связанные с неэффективностью проводимой противовоспалительной
терапии, персистенцией реакции дыхательных путей на холодовое воздействие [13, 18]. Одной из причин
может служить переход бронхиального воспаления с клеточно-органного на системный, организменный
уровень. Для оценки влияния генерализованного воспаления на функциональное состояние дыхательных путей
при неконтролируемом течении легкой БА была предпринята попытка найти взаимосвязь между ХГДП и
особенностями клеточного состава периферической крови.
Таблица 1
Функция внешнего дыхания и уровень контроля заболевания больных БА (М±m)
Показатели 1 группа 2 группа р
ОФВ 1 , % 91,3±2,7 98,0±2,4 0,08
ОФВ 1 /ЖЕЛ,% 73,7±1,5 76,6±1,1 0,08
МОС 25-75 ,% 66,1±4,0 76,9±3,5 0,035
ОФВ 1БЛ , % 16,8±3,7 8,4±1,1 0,006
АСТ, баллы 15,6±1,0 18,6±0,8 0,021
Примечание: БЛ – изменение показателя в ответ на введение бронхолитика.
Существуют научные исследования, в которых доказано, что бронхоконстрикторный эффект находится в
прямой зависимости от медиаторной активности эозинофилов. В результате дегрануляции эозинофилов
происходит экзоцитоз в ткани бронхов синтезированных в эозинофильных гранулах цистеиниловых
лейкотриенов (LTС4, LTD4 и LTE4) [1, 8] и цитотоксичного эозинофильного катионного протеина (ECP),
вызывающего деструкцию бронхиального эпителия [10]. Высокая концентрация тучных клеток и эозинофилов
в слизистой оболочке дистальных бронхов коррелирует с развитием бронхиальной гиперреактивности [10, 21].
Тучные клетки продуцируют и секретируют IL-5, PAF – фактор агрегации тромбоцитов и стимуляции секреции
гистамина, LTB4, вызывающий агрегацию и дегрануляцию нейтрофилов, а также активацию лейкоцитов и
миграцию нейтрофилов и эозинофилов в очаг воспаления [10]. При этом индуцируется высвобождение ECP,
который, в свою очередь, стимулирует тучноклеточный синтез и секрецию гистамина и простагландина D2,
являющегося хемоаттрактантом для эозинофилов и Th2 лимфоцитов посредством связывания рецептора
CRTH2, регулирует пролиферацию Т- и В-лимфоцитов [10, 17].
Найденные нами при исследовании лейкоцитарной формулы периферической крови больных 1 и 2 групп
средние показатели относительного количества эозинофилов (табл. 2) свидетельствовали не в пользу
генерализации эозинофильного воспаления. Данное обстоятельство с наибольшей вероятностью могло быть
обусловлено лёгким течением болезни у пациентов с ХГДП, сопровождающимся адаптивным ограничением
локального воспалительного процесса. Что касается абсолютного количества эозинофилов, то, в отличие от
процентной доли клеток в лейкоцитарной формуле, не имеющей межгрупповых различий, содержание
эозинофилов в расчёте на один микролитр крови больных с ХГДП было достоверно выше, чем в группе с
отсутствием реакции бронхов на ИГХВ (табл. 2).
Таблица 2
Базовый уровень содержания эозинофилов в периферической крови больных БА (Me [Q1; Q3])
Показатель 1 группа 2 группа р
Эозинофилы, абсолютное количество в мкл 186,0 [156,0; 224,0] 129,0 [112; 192,0] 0,007
Эозинофилы, относительное количество (%) 3,0 [2,0; 3,5] 3,0 [2,0; 4,0] >0,05
При сопоставлении клинико-функциональных и лабораторных данных было обнаружено, что значения
суммарного показателя контроля над БА (АСТ, баллы) и базовые фактические величины проходимости мелких
дыхательных путей (МОС 75 ) у исследованных пациентов находились в обратной корреляционной зависимости
от абсолютного количества эозинофилов в периферической крови (r=-0,33; р=0,031 и r=-0,31; р=0,025,
соответственно). Генерализация воспалительного процесса, стимулируемая генетически детерминированными
особенностями иммуногенеза, супрессией иммунной и антиоксидантной защиты, может обусловливать
7
рефрактерность к проводимой терапии, модулировать инертность снижения клинических проявлений астмы,
потенцировать возможность обострений даже при лёгком течении болезни. По некоторым данным, при лёгкой
астме тяжёлые обострения случаются в 30-40% случаях и требуют оказания экстренной помощи [11]. Терапия
ИГКС уменьшает воспаление бронхов, но оказывает лишь незначительное влияние на структурное
ремоделирование, и при прекращении лечения воспаление возвращается [11]. Уровни взаимосвязи между
характером воспаления, ремоделированием дыхательных путей, критериями контроля и тяжести астмы все ещё
далеки от понимания.
Выявление характера воспаления бронхиального секрета и профиля клеточных элементов
периферической крови можно рассматривать не только с точки зрения общих диагностических позиций в
аспекте прогноза клинического течения БА. По сути, данный подход является фенотип-ориентированным в
плане назначения противовоспалительной терапии, принимая во внимание, как особенности клеточной
организации бронхиального воспаления, так и показатели системной реакции организма, что позволяет
персонализировать медикаментозную терапию больных БА, в том числе в зависимости от характера реакции на
холодовой стимул.
Таким образом, больные с отсутствием контроля БА характеризуются индукцией гранулоцитарного
клеточного воспаления в бронхах под влиянием холодового триггера. Снижение уровня контроля над
заболеванием и функции внешнего дыхания у больных БА с ХГДП ассоциируется с увеличением абсолютного
количества эозинофилов в периферической крови.
