Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Ispol'zovanie iskusstvenno sozdannyh 3D skaffoldov na osnove kollagena ili zhelatina, povtoryayuschih usloviya mikrookruzheniya zhivogo organizma, stanovitsya vse bolee rasprostranennym. Etomu sposobstvuet uglublenie ponimaniya mezhkletochnyh vzaimodeystviy in vivo, chto pozvolyaet iskusstvenno sformirovat' podhodyaschuyu dlya kletok gistoarhitektoniku i mikrookruzhenie skaffolda. Zhelatin, kak proizvodnoe kollagena yavlyaetsya odnim iz perspektivnyh nedorogih materialov dlya sozdaniyah takih matric. Cel' issledovaniya – izuchit' morfologicheskie, biodegradiruemye svoystva, a takzhe skorost' degradacii skaffoldov in vivo i in vitro zhelatin-glutarovogo polimera, modificirovannogo digidrokvercetinom i arabinogalaktanom. Izuchenie morfologicheskih svoystv skaffolda provodili s pomosch'yu gistologicheskogo issledovaniya s okraskoy gematoksilin-eozin i skaniruyuschey elektronnoy mikroskopiey. Izuchenie skorosti degradacii skaffolda provodili pri temperature 37ºS i vozdeystvii fermentov (tripsin, kollagenaza). Degradaciyu in vivo izuchali morfologicheski posle podkozhnoy implantacii issleduemogo skaffolda laboratornym krysam. Pri morfologicheskom issledovanii ustanovleno, chto skaffold imeet vysokuyu poristost' – do 35-45%. Skaffold obladaet vysokoy termostabil'nost'yu i ne degradiruet pri 37ºS. Pri vozdeystvii rastvorami tripsina i kollagenazy I tipa, degradaciya nablyudaetsya v techenie 540±15 i 200±10 minut, sootvetstvenno. Pri morfologicheskom issledovanii degradacii in vivo, skaffold polnost'yu ischezaet v techenie 3 nedel', zamenyayas' granulyacionnoy tkan'yu. Poluchennye rezul'taty svidetel'stvuyut o vozmozhnosti ispol'zovaniya zhelatin-glutarovogo skaffolda, modificirovannogo digidrokvercetinom i arabinogalaktanom, dlya issledovaniy v oblasti tkanevoy inzhenerii legkih.
skaffold, tkanevaya inzheneriya legkih, poristost', zhelatin, digidrokvercetin.
Коллаген присутствует во всех типах соединительной ткани в легких, представляя одну из самых изученных молекул внеклеточного матрикса. Он является одним из основных компонентов легких и костной ткани, и занимает до 25% сухого веса млекопитающих. Существует 29 типов коллагена, имеющих схожую двухцепочечную структуру. Коллаген типов I, II, III, V и XI формирует структуру волокон, состоящую из α- цепей. Коллаген и его производные активно используются в биомедицине. Существуют различные варианты применения – от инъекционных форм до матриц, используемых в тканевой инженерии [9]. В настоящее время для создания тканеинженерных конструкций активно применяется коллаген I [6].
Желатин – гидролизат коллагена, сохраняющий ряд его биологических и физико-химических свойств. Это делает желатин перспективным материалом для биоинженерии. В зависимости от метода гидролиза коллагена, выделяют желатин А (гидролиз кислотой) и желатин В (гидролиз щелочью) [8]. В аминокислотном составе желатина отсутствует тирозин и триптофан, а уровень содержания фенилаланина минимальный. Это обусловливает низкий риск появления ароматических радикалов, сопряженных с иммуногенностью [13]. В связи с этим желатин обладает низкой иммуногенностью по сравнению с коллагеном. Биомеханические свойства желатина меняются при его взаимодействием с веществами, модифицирующими его структуру. Биосовместимость желатина и возможная деградация коллагеназами в ткани с моделированием in vivo позволяют использовать его для биомедицинских исследований [14].
Скаффолд – основа тканеинженерной конструкции легких и других органов, создаваемая на основе желатина, и необходимая для прикрепления, жизнедеятельности и пролиферации клеточных элементов. Его создание требует решения ряда задач на тканевом уровне: сформировать подходящее для клеток микроокружение из межклеточного вещества, обеспечить контакты «клетка–внеклеточный матрикс» и определить градиент растворимых и нерастворимых факторов (VEGF, PDGF, FGF и др.). Для решения указанных задач скаффолд на основе желатина должен сохранять свою архитектуру при температуре до 37ºС, повышенной влажности и быть устойчивым в отношении протеолитических ферментов. Подобные требования обусловлены процессами, происходящими в тканях при повреждении и регенерации. Для улучшения доставки питательных веществ и кислорода, а также возможности создания межклеточных контактов, скаффолд должен иметь пористую структуру [12, 17]. Создание пористой структуры скаффолда возможно несколькими путями: различные варианты 3D-биопечати, стереолитография и т.д. [11]. В настоящее время выделяют ряд методов повышения стабильности желатина для тканевой инженерии: химическое сшивание с помощью альдегидов кислот, использование ферментов и изменение температуры желатинизации [16].
Для получения порогенных скаффолдов в тканевой инженерии широко используется метод выщелачивания. Предложено несколько способов формирования необходимого размера пор на разных типах материала и этапах применения в моделировании тканей [15]. Кроме того, для применения скаффолда в клинической практике может быть перспективным использование ряда флавоноидов, придающих скаффолду противовоспалительные, антибактериальные и противовирусные свойства. В качестве одного из таких веществ мы рассматриваем производное полифенола кверцетина – дигидрокверцетин, природный антиоксидант, обладающий всеми вышеперечисленными эффектами [18]. Ряд исследований показал, что кверцетин и его производные обладают способностью вызывать химическую сшивку коллагена, повышая механическую стабильность скаффолда c использованием желатина [7]. Дигидрокверцетин вызывает снижение оксидативного стресса, повышает миграцию фибробластов в зону повреждения и способствует синтезу коллагена [4]. Полисахарид арабиногалактан также обладает сильными антиоксидантными свойствами и проявляет иммуномодулирующую активность [3]. Конъюгация дигидрокверцетина с арабиногалактаном способствует растворимости дигидрокверцетина в водных растворах [1].
Цель исследования – изучить морфологические, биодеградируемые свойства, а также скорость деградации скаффолдов in vivo и in vitro желатин-глутарового полимера, модифицированного дигидрокверцетином и арабиногалактаном.
Материалы и методы исследования
Скаффолды были изготовлены из пищевого желатина (ЗАО «Компания Проксима», Россия). Для создания пористой структуры использовали хлорид натрия (ООО «АО РЕАХИМ», Россия). В качестве антиоксиданта использовался препарат Лавитол-В (АО «Аметис», Россия), который является смесью дигидрокверцетина и арабиногалактана, с растворимостью в воде 8 г/л.
Нами было приготовлены стандартизированные по площади образцы скаффолдов: 26 пористых желатиновых скаффолдов методом выщелачивания хлорида натрия, 26 образцов пористых желатиновых скаффолдов с модификацией Лавитол-В, а также 10 образцов желатиновых скаффолдов без химической сшивки. Размеры скаффолдов – 5×5×2 мм. Скаффолды получали путем нанесения разогретого до 56ºС 20% раствора желатина на поверхность слоя хлорида натрия с размером кристаллов от 4 до 50 мкм в чашке Петри, в весовом соотношении 1:9. Для получения скаффолдов с Лавитол-B при приготовлении 20% раствора желатина добавляли Лавитол-B в концентрации 0,5% от общей массы раствора. Чашка Петри помещалась в термостат при 37ºС на 24 часа. После чего производилась химическая сшивка образца 2,5% раствором глутарового альдегида (Sigma Aldrich, Германия), приготовленного на фосфатно-солевом буфере при pH 7,4, путём добавления его в чашку Петри [10]. Выщелачивание хлорида натрия проводилось с помощью последовательной инкубации образцов в деионизированной воде на протяжении 48 часов со сменой растворов каждые 24 часа.
Структура полученных скаффолдов оценивалась с помощью светового микроскопа (Olympus BX46, Япония) и сканирующего электронного микроскопа (Hitachi-S3400N, Япония). Скаффолды фиксировались в 10% забуференном формалине, заливались в парафин с последующим этапом микротомии и окраски гематоксилином и эозином по стандартной схеме для светооптической микроскопии. Пробоподготовка для сканирующей электронной микроскопии осуществлялась последовательной дегидратацией и напылением золота на образцы скаффолдов по стандартному протоколу [5]. Исследование проходило при высоком вакууме, в стандартном режиме работы сканирующего электронного микроскопа. Проводилась оценка структуры, количества и размеров пор, наличия перемычек в скаффолде.
Оценка термостабильности осуществлялась путём погружения исследуемых скаффолдов в физиологический раствор (0,9% раствор хлорида натрия) с температурой 23ºС и 37ºС. Изменения оценивались визуально с фиксацией точки начала растворения скаффолда и точки его полной диссоциации в растворе.
Для исследования ферментативной стабильности мы использовали 0,25% трипсин (Sigma Aldrich, Германия) и коллагеназу I типа (≥125 CDU/мг) (Sigma Aldrich, Германия). Исследование ферментативной устойчивости осуществлялось путём инкубации пористых скаффолдов, массой 0,5 г при 37ºС и 23ºС в 0,25% раствора трипсина (0,1 мг/мл) и растворе коллагеназы I типа (2 мг/мл). Изменения оценивались визуально и по динамической массе скаффолдов. Фиксировалось время после начала растворения скаффолда и его полной диссоциации в растворе.
Были взяты 6 белых аутбредных крыс самцов, массой около 200 г, содержащихся в стандартных условиях вивария Амурской ГМА. Исследование выполнялось с соблюдением этических требований, предъявляемых к работе с экспериментальными животными (Приказ №755 МЗ ССР от 12.08.1977 г.). Наркоз осуществлялся с использованием диэтилового эфира (Sigma Aldrich, Германия). Для имплантации пористые скаффолды с Лавитол-В подвергались паровой стерилизации (121ºС, давление 2 атмосферы, 30 минут). Имплантация осуществлялась подкожно в латеральную часть спины с правой стороны. На коже делали разрез до подкожной жировой клетчатки до 10 мм в длину и формировали подкожные карманы с помощью хирургических ножниц. После погружения скаффолдов в подкожный карман, рану послойно ушивали с помощью хирургической иглы и ниток (кетгут).
Выведение животных проводилось на 7, 14 и 21 сутки эксперимента путём глубокого усыпления диэтиловым эфиром. Полученные участки кожи фиксировали в 10% забуференном формалине в течение суток и подвергали стандартному морфологическому исследованию с использованием программы для морфометрического анализа «QPath» (США) [2].
Статистическую обработку материалов производили с помощью программного обеспечения Excel (Microsoft Office 2016) в среде операционной системы Windows 10. Статистически значимое различие в группах между количественными параметрами с распределением, соответствующим нормальному закону, оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Дескриптивные статистики в тексте представлены как М±m, где М – среднее арифметическое, m – стандартная ошибка среднего. Различия во всех случаях считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Полученные с помощью метода выщелачивания образцы скаффолдов при гистологическом исследовании имеют высокую пористость, с размером пор от 1 до 100 мкм (рис. 1). Поры занимают от 35 до 45% площади скаффолда. При исследовании образцов с помощью сканирующей электронной микроскопии, нативный желатин имеет монолитную структуру без пор (рис. 2). Скаффолд, полученный методом выщелачивания, характеризуется большим количеством пор различного размера и соединяющих их каналов (рис. 3). Мы не нашли значительных отличий в морфологической структуре пористых скаффолдов с Лавитол-В в сравнении с пористых скаффолдами без Лавитол-B, что свидетельствовало об отсутствии негативного влияния добавки.
|
|
|
|
Рис. 1
|
Рис. 2
|
|
|
Рис. 1. Пористый скаффолд на основе 20% раствора желатина, приготовленного методом выщелачивания. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: 40. Рис. 2. Нативный скаффолд на основе 20% раствора желатина. Сканирующая электронная микроскопия. Напряжение: 30 кВ. Увеличение: 73. Рис. 3. Пористый скаффолд на основе 20% раствора желатина, полученный методом выщелачивания. Сканирующая электронная микроскопия. Напряжение: 30 кВ. Увеличение: 100. |
|
Рис.3 |
При изучении устойчивости к протеолитическим ферментам были получены следующие результаты (табл.). Желатин без модификаций демонстрировал наименьшую устойчивость к воздействию трипсина и коллагеназы. В то же время, при температуре 37ºС 20% пористый скаффолд из желатина показывал лучшие результаты по устойчивости к воздействию ферментов. Анализ времени до полного распада образцов выявил достоверные различия в ферментативной устойчивости между разными вариантами модификаций скаффолдов и скаффолдами из нативного желатина (p<0,05).
Таблица
Ферментативная деградация скаффолдов
|
Название образца |
Время полного распада образцов скаффолдов при 37ºС (представлено среднее арифметическое при n=3) |
|
|
Вид ферментативной деградации |
||
|
Трипсин (0,25 мг/мл) |
Коллагеназа I типа (2 мг/мл) |
|
|
Желатин 20% |
4±0,5 минут |
30±5 минут |
|
Желатин 20% + NaCl |
600±15 минут* |
240±10 минут* |
|
Желатин 20% + 0,5% Лавитол-B + NaCl |
540±15 минут* |
200±10 минут* |
Примечание: * – достоверность различий по времени ферментативной деградации между разными вариантами модификаций скаффолдов и скаффолдами из нативного желатина (p<0,05).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что образцы, приготовленные методом выщелачивания, имели достоверно значимые отличия по времени ферментативной деградации в сравнении со скаффолдами из нативного желатина. При этом в ходе эксперимента в течение 24 часов при 37ºС не было выявлено никаких изменений структуры во всех образцах скаффолдов, полученных методом выщелачивания. Данные свидетельствуют о том, что использование хлорида натрия и Лавитол-B не оказывало достоверного влияния на термостабильность желатина, при фиксации последнего глутаровым альдегидом.
|
|
Рис. 4. Микрофотография имплантированного пористого скаффолда желатина под кожу крысе. 7 сутки. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: 40. |
|
|
|
|
|
|
|
Рис. 5. Микрофотография имплантированного пористого скаффолда желатина под кожу крысе. 21 сутки. В зоне имплантации единичные фрагменты скаффолда, слабовыраженные фокусы гистиоцитарной инфильтрации на фоне выраженной васкуляризации в этой зоне. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: 40. |
|
Исследование биодеградации скаффолдов на крысах показало следующие результаты. В месте имплантации пористого скаффолда с Лавитол-В на 7 сутки развивалась воспалительная реакция с появлением гигантских многоядерных клеток инородных тел, с фокусами лимфогистиоцитарной инфильтрации (рис. 4). Кроме того, на 14 сутки в структуре скаффолда появлялись элементы соединительной ткани с тонкими нежными волокнами коллагена, возрастало количество капилляров, объем скаффолда уменьшался. На 21 сутки эксперимента в месте имплантации исчезали практически все структуры скаффолда, уменьшалась лимфогистиоцитарная инфильтрация, грубоволокнистая соединительная ткань отсутствовала (рис. 5). В тканях развивалась только неспецифическая реакция на трансплантат и отмечались изменения, характерные для физиологической регенерации. Выявленные результаты свидетельствовали об отсутствии адаптивного иммунного ответа на имплантированный скаффолд.
Полученные данные имеют значение для тканевой инженерии и 3D-клеточного культивирования. Высокая пористость и структура скаффолда с возможностью регулирования размера пор, его постепенная биодеградация in vitro позволяют использовать скаффолд в научных исследованиях, связанных с изучением легких при различных патологических состояниях. Имеющиеся поры и каналы, соединяющие их, создают условия для межклеточного взаимодействия с учетом градиента растворимых и нерастворимых факторов (адгезионные участки желатина, цитокины, факторы роста и пр.). Скаффолд обладает низкой иммуногенностью и после имплантации in vitro полностью замещается соединительной тканью, без формирования хронического грануляционного воспаления. Проведённые исследования термостабильности порогенных скаффолдов показали, что образцы не деполимеризуются при 37ºС, что позволяет использовать их для тканевой инженерии легких in vivo.
1. Ostronkov V.S., Lashin S.A. Patent 2533231 RU. Supramolecular complex with anti-inflammatory and angioprotective activity; Published 11.20.2014 (in Russian).
2. Bankhead, P., Loughrey, M., Fernández, J., Dombrowski, Y., McArt, D., Dunne P., McQuaid S., Gray RT, Murray LJ, Coleman HG, James JA, Salto-Tellez M., Hamilton PW QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci. Rep. 2017; 7 (1): 816878. doi: 10.1038 / s41598-017-17204-5
3. Dion C., Chappuis E., Ripoll C. Does larch arabinogalactan enhance the immune function? A review of mechanistic and clinical trials. Nutr. Metab. (Lond). 2016; 13:28. doi: 10.1186 / s12986-016-0086-x
4. Doersch, K., Newell-Rogers, M.V. and β1 integrin expression. Exp. Biol. Med. (Maywood) 2017; 242 (14): 1424-1431. doi: 10.1177 / 1535370217712961
5. Fischer E., Hansen B., Nair V., Hoyt F., Dorward D. Scanning electron microscopy. Curr. Protoc. Microb. 2012; 25 (1): 2B.2.1-2B.2.47. doi: 10.1002 / 9780471729259.mc02b02s25
6. Gelse K., Pöschl E., Aigner T. Collagens - structure, function, and biosynthesis. Adv. Drug. Deliv. Rev. 2003; 55 (12): 1531–1546. doi: 10.1016 / j.addr.2003.08.002
7. Kim Y., Tarahovsky Y., Gaidin S., Yagolnik E., Muzafarov E. (2017). Flavonoids determine the in vitro fibrillogenesis and structure of collagen type I fibrils. Int. J. Biol. Macromol. 2017; 104 (PtA): 631–637. doi: 10.1016 / j.ijbiomac.2017.06.070
8. Lee B., Lum N., Seow L., Lim P., Tan L. Synthesis and characterization of A and B gelatin methacryloyl for bioink applications. Materials (Basel) 2016; 9 (10): E797. doi: 10.3390 / ma9100797
9. Lee C., Singla A., Lee Y. Biomedical applications of collagen. Int. J. Pharm. 2001; 221 (1-2): 1–22. doi: 10.1016 / s0378-5173 (01) 00691-3
10. Maji K., Dasgupta S., Pramanik K., Bissoyi, A. gelatin-chitosan-nanobioglass 3d porous scaffold for bone tissue engineering. Int. J. Biomater. 2016; 2016: 9825659. doi: 10.1155 / 2016/9825659
11. Murphy C., O’Brien F. Understanding collagen-glycosaminoglycan scaffolds. Cell Adh. Migr. 2010; 4 (3): 377–381. doi: 10.4161 / cam.4.3.11747
12. Murphy C., Haugh M., O'Brien F. Collagen – glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 2010; 31 (3): 461–466. doi: 10.1016 / j.biomaterials.2009.09.063
13. Rose J., Pacelli S., Haj A., Dua H., Hopkinson A., White L., Rose F. Gelatin-based materials in ocular tissue engineering. Materials (Basel) 2014; 7 (4): 3106–3135. doi: 10.3390 / ma7043106
14. Tondera C., Hauser S., Krüger-Genge A., Jung F., Neffe A., Lendlein A., Klopfleisch R., Steinbach J., Neuber C., Pietzsch J. Gelatin-based hydrogel degradation and tissue interaction in vivo: insights from multimodal preclinical imaging in immunocompetent nude mice. Theranostics 2016; 6 (12): 2114-2128. doi: 10.7150 / thno.16614
15. Tran, R., Naseri, E., Kolasnikov, A., Bai, X., Yang, J. Biotechnol. Appl. Biochem. 2011; 58 (5): 335-344. doi: 10.1002 / bab.44
16. Van Vlierberghe S. Crosslinking strategies for porous gelatin scaffolds. J. Mater. Sci. 2016; 51 (9): 4349-4357. doi: 10.1007 / s10853-016-9747-4
17. Yang S., Leong K., Du Z., Chua C. The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors. Tissue Eng. 2001; 7 (6): 679–689. doi: 10.1089 / 107632701753337645
18. Zhang Y., Yu J., Dong X., Ji H. Research on characteristics, antioxidant and ant groups. Molecules 2017; 23 (1): E20. doi: 10.3390 / molecules23010020
