, Russian Federation
Abstract. Currently, there is the possibility of more detailed studies to the study of oocytes and somatic cells (granulosa cells). The possibility to develop successful models of maturation of female gametes defines the possibility to improve existing methods for the selection of donor eggs and the search for new donor eggs. Oocyte maturation in vivo occurs with the participation of structural follicle elements and follicular fluid [3, 4, 6]. Granulosa cells are widely used in bovine oocyte maturation systems and used in cloning and transgenesis technologies [8, 13]. Purpose of this study: to perform destructive changes granulosa cells in ovarian follicles of bovines (Ø 3–5 mm),which contain growing(ВСВ–) or completed the growth phase of oocytes (ВСВ+). Methods: Functional testing of oocytes wascarried out using the vital dye BCB (brillant cresyl blue – diamond crystal blue) [10]. Viability indices in granulosa cells isolated from follicles that contain oocyte s that grow or complete the growth phase were determined by flow cytometry. The result. It was found, that cellsof granulosa from cow follicles are characterized by different indicators of apoptosis levels depending on the status of oocytes (completed growth and growing) isolated from these follicles. The proportion of apoptotic granulosa cells in bovine follicles of containing oocytes that completed the growth phase, exceeded that in follicles containing growing oocytes by 11 % (29 % vs. 18 %, c:dP < 0.05). The scientific novelty: The data obtained using flow cytometry, allow us to evaluate the level of apoptosis in granulosa cells of bovine ovarian follicle as indicator of functional status of developing oocytes (growing or completed growth phases). This indicator can be used in prognosis of competencies for maturation of bovine oocytes.
oocyte, granulosa, apoptosis, bovine, brilliant cresyl blue, in vitro.
Постановка проблемы (Introduction)
Появление новых технологических возможностей в клеточных репродуктивных технологиях (клонирование и трансгенез) определяет важность первичного этапа – отбора качественных донорских яйцеклеток для культивирования. Методика ранжирования ооцит-кумулюсных комплексов с учетом морфологических критериев (число слоев кумулюсных клеток, ширина зоны пеллюцида, зернистость ооплазмы) долгое время являлась единственной. Визуальная оценка донорских ооцитов, выделенных из фолликулов яичников живых животных (трансвагинальная аспирация) или из постмортальных яичников, во многом зависит от профессиональных компетенций эмбриотехнологов. В качестве способа оценки компетентности яйцеклетки к дальнейшему созреванию предложена диагностика функционального статуса ооцитов, основанная на разнице в активности фермента глюкозо-6 фосфат дегидрогеназы (G6PDH). На момент аспирации ооциты в фолликулах могут находиться в разном функциональном состоянии: растущие ооциты (ВСВ-) и ооциты, завершившие фазу роста (ВСВ+). Разделить эту гетерогенную популяцию стало возможным с помощью инвазивного витального красителя ВСВ (brillant cresyl blue – бриллиантовый кристаллический голубой) [10]. BСB-тест основан на способности G6PDH конвертировать окраску BСB из голубой в бесцветную в растущих ооцитах (ВСВ–), а в цитоплазме завершивших стадию роста ооцитах (ВСВ+) BСB-краситель не теряет цвет. Созревание яйцеклетки in vivo происходит при участии структурных элементов фолликула, содержащихся в фолликулярной жидкости, состав которой, безусловно, влияет на качество женской гаметы [3, 4, 6]. Фолликул выполняет две главные функции: продуцирование гормонов и обеспечение роста ооцитов, компетентных к оплодотворению [3, 11]. Клетки гранулезы необходимы для роста и дифференциации ооцитов, нормального протекания мейоза, цитоплазматического созревания, а также контроля транскрипционной активности в яйцеклетках [12, 13, 15]. Гетерогенность ооцитов регулируется на уровне клеточных популяций, и одним из таких механизмов может быть универсальный процесс программированной клеточной гибели – апоптоз, который характерен для единичных клеток или их кластеров яйцеклетках [1, 14]. Этот процесс отвечает за развитие доминантного фолликула и желтого тела, фолликулярную атрезию и овуляцию [2, 7]. Мониторинг деструктивных изменений гранулезных клеток овариальных фолликулов может явиться ключевым моментом в изучении механизмов формирования полноценной яйцеклетки [8, 13].
Методология и методы исследования (Methods)
В экспериментах использовали постмортальные яичники коров разного возраста. Яичники доставляли в лабораторию в термосе в стерильном физиологическом растворе при температуре 32–35 °С. Объектом исследования служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) и клетки гранулезы (КГ), которые получали путем аспирации жидкости из 453 фолликулов диаметром 3–5 мм с заметно выраженной васкуляризацией и тургором. Аспират, полученный из каждого фолликула, переносили в одну из лунок 96-луночных плат до оценки функционального статуса ооцита. Для экспериментов отбирали ооциты округлой формы, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным кумулюсом. Для проведения ВСВ-теста ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) коров отмывали в растворе Дюльбекко с добавлением 0,4 % бычьего сывороточного альбумина, затем помещали на 90 минут в 26µМ раствор BCB, приготовленного на основе Дюльбекко. После этого аспираты ФЖ разделяли в соответствии с функциональным статусом находившегося в нем ооцита (растущий или завершивший фазу роста) и центрифугировали при 250g в течение 10 минут. Далее удаляли супернатант, а клетки гранулезы дважды отмывали путем ресуспендирования в фосфатно-солевом буфере. Инкубировали КГ в течение 3 часов при температуре 37 °С в фосфатно-солевом буфере с добавлением 5 % сыворотки крупного рогатого скота. Для оценки экстернализации фосфатидилсерина к клеточной суспензии (1,3×106 клеток/мл) добавляли зонд к аннексину-V (AnV) и йодистый пропидий (PI) (набор AnnexinV-FITC Apoptosisdetectionkit, Sigma-Aldrich, США) согласно инструкции, Анализ проводили на проточном цитометре Cytomics FC 500. Обработка полученных результатов осуществлялась при помощи программного обеспечения Kaluza™ (BeckmanCoulter, США). Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: P < 0,05; P < 0,01; P < 0,001 для 3 независимых экспериментов с использованием χ²-тест (статистическая программа SigmaStat). Все использованные в исследовании реагенты, за исключением указанных, производства Sigma-Aldrich. Цель настоящего исследования – проанализировать деструктивные изменения клеток гранулезы в овариальных фолликулах коров (Ø 3–5 мм), содержащих растущие (ВСВ–) или завершившие фазу роста ооциты (ВСВ+).
Результаты (Results)
Количество апоптотических клеток определялось как доля клеток, окрашенных аннексином V, но не окрашенных йодистым пропидием (фракция AnV+/PI–), и выражалось в процентах от общего количества анализируемых клеток. Идентификация некроза базируется на способности йодистого пропидия проникать только в клетки с поврежденной мембраной. Для апоптоза характерно сохранение целостности мембраны вплоть до последних этапов программированной клеточной гибели [5]. Таким образом, живые клетки не будут окрашиваться ни одним красителем (AnnexinV–/PI–), апоптотические клетки будут окрашиваться аннексином V (AnV+), некротические клетки и клетки на поздних стадиях апоптоза будут окрашиваться йодистым пропидием или обоими красителями сразу (AnnexinV+–/PI+). Мониторинг деструктивных процессов в клетках гранулезы овариальных фолликулов коров выявил достоверные различия между уровнем апоптозов гранулезных клеток фолликулов, содержащих растущие или завершившие фазу роста ооциты (18 % против 29 %, c:dР < 0,05, (критерий χ2)). Доля живых клеток гранулезы в фолликулах, содержащих завершившие фазу роста ооциты, была значительно меньше таковой в фолликулах, содержащих растущие ооциты (62 % против 76 %, a:bР < 0,05, (критерий χ2)). Оценка некротических процессов исследуемых образцов показала, что уровень клеток с некрозом и клеток на поздних стадиях апоптоза в фолликулах, содержащих завершившие фазу роста ооциты, был выше по сравнению с этим показателем у клеток гранулезы из фолликулов, содержащих растущие ооциты (11 % против 6 %, e:fР < 0,05 (критерий χ2).
Обсуждение и выводы. Discussion and Conclusion
В результате исследования установлено снижение количества жизнеспособных, функционально активных клеток гранулезы в овариальных фолликулах с ооцитами, ранжированными как завершившие фазу роста (ВСВ+). Напротив, доля живых клеток гранулезы, участвующих в формировании компетенции ооцита к созреванию, выше в клетках гранулезы из фолликулов с растущими ооцитами (ВСВ–). Полученные с помощью проточной цитометрии данные о деструктивных изменениях в клетках гранулезы овариальных фоликулов коров с учетом функционального статуса содержащегося в них ооцита (растущие и завершившие фазу роста) позволяют использовать уровень апоптозов гранулезных клеток как показатель при прогнозировании качества донорских ооцитов коров.
Работа выполнена в соответствии с темой Министерства образования Российской Федерации, номер госрегистрации – АААА-А18-118021590132-9.
1. Dvoryashina I. A. [i dr.] Sovremennyy vzglyad na mehanizmy i klassifikaciyu kletochnoy gibeli // Vestnik Volgogradskogo gosudarstvennogo medicinskogo universiteta. 2016. № 3. S. 59.
2. Kosyakova G. P., Proshin S. N., Shabanov P. D., Glushakov R. I. Izmeneniya kletok granulezy follikulov v stadii atrezii, registriruemye s pomosch'yu flyuorohromov // Morfologicheskie vedomosti. 2014. № 2. S. 41–47.
3. Kuz'mina T. I., Mutieva H. M., Novichkova D. A. Morfologiya hromatina somaticheskih kletok ovarial'nyh follikulov korov – indikator funkcional'nogo statusa oocita // Genetika i razvedenie zhivotnyh. 2014. № 1. S. 8–11.
4. Singina G. N., Lebedeva I. Yu., Shedova E. N., Taradaynik T. E., Mityashova O. S., Cyndrina E. V., Danch S. S. Sposobnost' oocitov korov k embrional'nomu razvitiyu pri sozrevanii v raznyh sistemah dvuhfaznogo kul'tivirovaniya // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. 2017. T. 52. № 4. S. 776–784. DOI: 10.15389/agrobiology.2017.4.776rus.
5. Bravo-San Pedro J. M., Vitale I., Aaronson S. A. [et al.] Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015 // Cell Death and Differentiation. 2015. V. 22. Pp. 58–73. DOI: 10.1038/cdd.2014.137.
6. Bunel A., Nivet A. L., Blondin P., Vigneault C., Richard F. J. & Sirard M. A. // Cumulus cell gene expression associated with preovulatory acquisition of developmental competence in bovine oocytes // Reproduction, Fertility, and Development. 2014. V. 26. Pp. 855–865. DOI: 10.1071/RD13061.
7. Feng W., Pan Z. The effect of granulosa cells apoptosis on the cumulus expansion and the developmental competence of bovine oocytes // Advanced Materials Research. 2014. V. 997. Rp. 251–254. DOI: 10.4028/www.scientific.net/AMR.997.251.
8. Galli C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a personal perspective // Animal Reproduction. 2017. V. 14. No. 3. Pp. 614–621. DOI: 10.21451/1984-3143-AR1005.
9. Kuzmina T., Molchanov A., Stanislavovich T., Tatarskaya D. Developmental competence of bovine oocytes that have not finished growth phase in vivo // Anim. Reprod. 2016. V. 13. No. 3. Pp. 651.
10. Kuzmina T., Molchanov A., Stanislavovich T., Tatarskaya D. Steroid levels in fluid of bovine follicules containing growing or fully grown oocytes // Reproduction in domestic animals. 2017. V. 52. S. 3. Pp. 103.
11. Macaulay D. Angus, Gilbert I., Scantland S., Fournier E., Ashkar F., Bastien A., Shojaei Saadi H. A., Gagne D., Sirard M.-A., Khandjian E´ douard W., Richard F. J., Hyttel P., Robert C. Cumulus cell transcripts transit to the bovine oocyte in preparation for maturation // Biology of reproduction. 2016. V. 94. No. 1:16. Pp. 1–11. DOI: 10.1095/biolreprod.114.127571.
12. Mazzoni [et al.] Transcriptomic analysis of follicular cells for IVP oocyte competence // Animal Reproduction. 2017. V. 14. No. 3. Pp. 482–489.
13. Melo E. O., Cordeiro D. M., Pellegrino R., Wei Z., Daye Z. J., Nishimura R. C., Dode M. A. Identification of molecular markers for oocyte competence in bovine cumulus cells // Stichting International Foundation for Animal Genetics. 2016. V. 48. Pp. 19–29. DOI: 10.1111/age.12496.
14. Sinderewicz E., Grycmacher K., Boruszewska D., Kowalczyk-Zieba I., Staszkiewicz J., Slesak T., Woclawek-Potocka I. Expression of factors involved in apoptosis and cell survival is correlated with enzymes synthesizing lysophosphatidic acid and its receptors in granulosa cells originating from different types of bovine ovarian follicles // Reproduction Biology Endocrinol. 2017. V. 15. Pp. 72. DOI: 10.1186/s12958-017-0287-9.
15. Sonigo C, Grynberg M. In vitro oocyte maturation for female fertility preservation // Gynecol Obstet Fertil. 2014. V. 42. Pp. 657–660. DOI: 10.1016/j.gyobfe.2014.07.009.
