Постановка проблемы (Introduction)
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС, «голубой аборт», «синее ухо») – высококонтагиозное заболевание, которое наносит значительный экономический урон свиноводству многих стран. Заболевание характеризуется респираторными нарушениями, цианозом кожи ушей и других органов, поздними абортами и мертворождением. Впервые заболевание наблюдалось в США и Канаде в 1986 году, затем оно быстро распространилось в Европу с развитым свиноводством. В 1991 году на первичной культуре клеток свиней был выделен возбудитель вируса [3]. Возбудителем РРСС является РНК-содержащий вирус размером 45–65 нм, имеющий наружную оболочку и чувствительный к липидным растворителям. Возбудитель РРСС относится к семейству Arteriviridae, роду Arterivirus, для него характерна антигенная вариабельность. Каждый год в разных странах мира выделяют новые изоляты вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Изоляты делят на 2 типа по антигенным и генетическим различиям: европейский (Lelystad) и американский (VR-2332). Несмотря на это, до сих пор существуют трудности при выделении вируса и его адаптации в течение длительного культивирования к первичным и перевиваемым культурам клеток. Вирус РРСС успешно репродуцируется в легочных альвеолярных макрофагах (АМФ) поросят. МА-104 и MARC-145 (клоновый вариант, полученный из перевиваемой культуры клеток почки африканской зеленой мартышки) являются чувствительными к репродуктивно-респираторному синдрому свиней.
Методология и методы исследования (Methods)
Целью наших исследований было определение чувствительности к изоляту вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней линий культур клеток, что необходимо для получения высокоактивного антигена как главного компонента диагностических и вакцинных биопрепаратов.
Изолят вируса был выделен в ФГБНУ ВНИТИБП от больного поросенка из ЛПХ Московской области Коломенского района на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней (АМС) и подтвержден результатами ПЦР. Изолят вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом ПЦР был охарактеризован как европейский – генотип 1. Культуральные свойства изолята изучали на перевиваемых линиях культур клеток МА-104, MARC-145 (клон культуры МА-104, полученный из почки мартышки), РК-15 и Vero. Культуры клеток заражали по 0,001–1,0 ТЦД50/кл. вируссодержащим материалом и инкубировали при температуре (37,0 ± 0,5) °С в течение 3–9 суток, оценивая состояние монослоя. Для репродукции вируса и культивирования клеток применяли среду ДМЕМ с содержанием 5–10-процентной фетальной сыворотки крупного рогатого скота. ДМЕМ получали в готовом для использования виде из ООО «БиолоТ» (Санкт-Петербург) и из ООО «ПанЭко» (Москва). Сухой компонент ДМЕМ для приготовления питательной среды по инструкции производителя заказывали в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ВБ) «Вектор» Роспотребнадзора (Новосибирск). Методом ПЦР в реальном времени подтверждали присутствие генома вируса в исследуемых пробах. Обнаружение антигена вируса в зараженной культуре клеток определяли по проявлению специфического свечения в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) в монослое культуры клеток, фиксированной ацетоном. Результаты исследований учитывали с помощью цифровой цветной камеры CMOS 5 Мпикс, адаптера 0,35 С-mount для микроскопа Olympus с подключением компьютера с портом USB 3.0. Биологическую активность полученных материалов определяли путем титрования, титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД50/см3 [1]. Изолят вируса в культурах клеток культивировали в течение трех последовательных пассажей с последующим определением биологической активности полученных вируссодержащих материалов в культуре клеток.
Результаты (Results)
Проведенные комплексные исследования, включающие вирусологические, молекулярно-генетические методы, подтвердили принадлежность выделенного изолята к репродуктивно респираторному синдрому свиней европейского типа. Выделенный изолят обладал типичными для данного вируса культуральными свойствами и имел высокую степень идентичности к генетической линии репродуктивно-респираторного синдрома свиней, относящегося к европейскому генотипу. В результате проведённых исследований получены следующие данные, которые в сокращенном виде приведены в таблице 1 и представлены на рисунке.
Таблица 1
Результаты исследования активности вируссодержащего материала
|
Наименование |
Номер пассажа вируса |
Период репродукции вируса, часы |
ПЦР: Ct ≤ 40 – положительный результат, Ct ˃ 40 – отрицательный результат |
Инфекционная активность вируса, ТЦД50/см3 |
|
РК-15 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 23,68 Ct = 23,88 Ct = 23,94 |
5,05 ± 0,21 5,01 ± 0,13 4,97 ± 0,12 |
|
МА-104 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 22,58 Ct = 19,92 Ct = 13,29 |
5,25 ± 0,22 5,33 ± 0,25 5,22 ± 0,24 |
|
MARC-145 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 16,75 Ct = 23,10 Ct = 18,09 |
5,69 ± 0,21 5,13 ± 0,19 5,22 ± 0,15 |
|
Vero |
1 2 3 |
4 |
Ct = 14,86 Ct = 20,17 Ct = 17,03 |
4,61 ± 0,15 4,57 ± 0,17 4,39 ± 0,14 |
Table 1
The results of the study of the biological activity of virus-containing material
|
Name |
Virus passage number |
Virus reproduction period, hours |
PCR: Ct ≤ 40 – positive, Ct ˃ 40 – negative
|
Infectious activity of the virus,
TСD50/cm3
|
|
РК-15 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 23.68 Ct = 23.88 Ct = 23.94 |
5.05 ± 0.21 5.01 ± 0.13 4.97 ± 0.12 |
|
МА-104 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 22.58 Ct = 19.92 Ct = 13.29 |
5.25 ± 0.22 5.33 ± 0.25 5.22 ± 0.24 |
|
Мarc-145 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 16.75 Ct = 23.10 Ct = 18.09 |
5.69 ± 0.21 5.13 ± 0.19 5.22 ± 0.15 |
|
Vero |
1 2 3 |
4 |
Ct = 14.86 Ct = 20.17 Ct = 17.03 |
4.61 ± 0.15 4.57 ± 0.17 4.39 ± 0.14 |
Рис. Культура клеток MARC-145 неинфицированная (контрольная) и инфицированная вирусом РРСС. Увеличение 1×20, камера с монитором HDM
Fig. Cell culture MARC-145 uninfected (control) and infected with swine reproductive and respiratory syndrome virus. Magnification 1×20, the camera monitor with HDM
Инфекционная активность вируса составляла в среднем 5,5 ± 0,5 lg ТЦД50/см3. В процессе пассирования отмечали постепенное накопление вируса. Данные свидетельствуют о том, что титр вируса в культуре клеток MARC-145 находился на достаточно высоком уровне, увеличился к пятому пассажу на 0,47 ± 0,01 логарифма и составил 5,12 ± 0,04 lg ТЦД50/см3. Также провели опыты по определению множественности заражения и времени культивирования вируса. Использовали дозы заражения 0,01; 0,1 и 1,0 ТЦД50/кл. Результаты показали, что при использовании дозы заражения 0,1 ТЦД50/кл отмечали наиболее высокое накопление вируса. С увеличением срока культивирования его инфекционная активность повышалась и достигала максимума к 96 часам, титр вируса составил 5,04 ± 0,14 lg ТЦД50/см3 при множественности заражения 0,1 ТЦД50/кл, в то время как при множественности заражения 0,01 ТЦД50/кл титр вируса к 96 часам составил 4,57 ± 0,16 lg ТЦД50/см3, а при 1,0 ТЦД50/кл – 4,68 ± 0,14 lg ТЦД50/см3. Инфекционная активность вируса на культуре MARC-145 составляла в среднем после трех первых пассажей (после адаптации) 5,51 ± 0,45 lg ТЦД50/см3.
С целью предоставления изоляту вируса наилучших условий для репродукции все культуры клеток, участвующие в настоящем исследовании, адаптировали к питательным средам, сывороткам, глютамину, промывочным и диспергирующим растворам и т. п. В процессе исследования чувствительности изолята вируса к перевиваемым линиям клеток было установлено, что питательные среды разных производителей оказывали значительное влияние на количество посевной концентрации клеток и качество полученного монослоя. Суспензию клеток МА-104, РК-15, MARC-145 и Vero с концентрацией от 70 до 400 тыс. в см3 вносили в разные культуральные сосуды. Качество монослоя оценивали через каждые 2 часа после посева в течение рабочего дня. При испытании влияния ростовых питательных сред ДМЕМ разных изготовителей на скорость и качество формирования монослоя клеток MARC-145 в данные среды добавляли 7–10 % сыворотки крови крупного рогатого скота, 0,5–0,7 мг/см3 глютамина. Результаты исследований по оценке оптимальной посевной концентрации клеток на примере культуры MARC-145 при использовании питательных сред разных производителей представлены в таблицах 2–4.
Таблица 2
Скорость формирования и качество монослоя в зависимости от посевной концентрации клеток MARC-145 при использовании ДМЕМ ООО «БиолоТ», n = 4
|
Концентрация клеток, тыс. в см3 |
Формирование монослоя, часы |
Визуальная оценка качества монослоя |
|
70 ± 10 |
100 ± 2 |
Неудовлетворительно |
|
100 ± 10 |
91 ± 1 |
Неудовлетворительно |
|
150 ± 10 |
72 ± 0,5 |
Удовлетворительно |
|
200 ± 10 |
37 ± 0,3 |
Хорошо |
|
250 ± 10 |
27 ± 0,8 |
Плотный монослой |
|
300 ± 10 |
25 ± 0,7 |
Плотный монослой с небольшим вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
350 ± 10 |
22 ± 0,9 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
400 ± 10 |
20 ± 0,4 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
Table 2
The rate of formation and quality of the monolayer depending on the inoculum concentration of MARC-145 cells when using DMEM “BioloT”, n = 4
|
The concentration of cells, thousand in cm3 |
Monolayer formation, hours |
Visual assessment of monolayer quality |
|
70 ± 10 |
100 ± 2 |
Unsatisfactorily |
|
100 ± 10 |
91 ± 1 |
Unsatisfactorily |
|
150 ± 10 |
72 ± 0.5 |
Satisfactorily |
|
200 ± 10 |
37 ± 0.3 |
Good |
|
250 ± 10 |
27 ± 0.8 |
Dense monolayer |
|
300 ± 10 |
25 ± 0.7 |
Dense monolayer |
|
350 ± 10 |
22 ± 0.9 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
|
400 ± 10 |
20 ± 0.4 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
Таблица 3
Скорость формирования и качество монослоя в зависимости от посевной концентрации клеток MARC-145 при использовании ДМЕМ ООО «ПанЭко», n = 4
|
Концентрация клеток, тыс. в см3 |
Формирование монослоя, часы |
Визуальная оценка качества монослоя |
|
70 ± 10 |
100 ± 4,0 |
Неудовлетворительно |
|
100 ± 10 |
91 ± 2,0 |
Неудовлетворительно |
|
150 ± 10 |
82 ± 3,0 |
Удовлетворительно |
|
200 ± 10 |
37 ± 3,1 |
Удовлетворительно |
|
250 ± 10 |
29 ± 2,12 |
Хорошо |
|
300 ± 10 |
25 ± 0,6 |
Хорошо |
|
350 ± 10 |
28 ± 1,1 |
Плотный монослой |
|
400 ± 10 |
26 ± 1,3 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
Table 3
The rate of formation and quality of the monolayer depending on the seeding concentration of MARC-145 cells when using DMEM “PanEco”, n = 4
|
The concentration of cells, thousand in cm3 |
Monolayer formation, hours |
Visual assessment of monolayer quality |
|
70 ± 10 |
100 ± 4.0 |
Unsatisfactorily |
|
100 ± 10 |
91 ± 2.0 |
Unsatisfactorily |
|
150 ± 10 |
82 ± 3.0 |
Satisfactorily |
|
200 ± 10 |
37 ± 3.1 |
Satisfactorily |
|
250 ± 10 |
29 ± 2.12 |
Good |
|
300 ± 10 |
25 ± 0.6 |
Good |
|
350 ± 10 |
28 ± 1.1 |
Dense monolayer |
|
400 ± 10 |
26 ± 1.3 |
Dense monolayer |
Удовлетворительный культуры клеток MARC-145 на ДМЕМ ООО «БиолоТ» получали через 72 ± 0,5 часа при посевной концентрации 150 ± 10 тыс. кл/см3. При посеве более низкой посевной концентрации клеток монослой формировался значительно позднее. Применение при посевной концентрации более 250 тыс. клеток в см3 приводило к формированию плотного монослоя с вытеснением клеток и их росту на поверхности монослоя. Удовлетворительный монослой культуры клеток MARC-145 на ДМЕМ ООО «ПанЭко» получали через 37 ± 3,1 часа при посевной концентрации не менее 200 ± 10 тыс. кл/см3. При использовании питательной среды ДМЕМ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» удовлетворительный результат формирования монослоя получали через 79 ± 2,0 часа после начала культивирования при посевной концентрации 100 тыс. клеток в см3.
При использовании питательной среды ДМЕМ производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» при репродукции вируса сформировавшийся монослой всех типов культур клеток, используемых в экспериментах, был всегда плотный и ровный. Питательные cреды ДМЕМ других производителей могли приводить к образованию изолированных зон роста клеток, которые не всегда смыкались в сплошной монослой даже через 72 часа после высева клеток в культуральные сосуды. Поэтому во всех дальнейших исследованиях по изучению изолятов вируса, в том числе и с целью получения диагностических и вакцинных препаратов было принято решение использовать только питательные среды, поставленные из ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Таблица 4
Скорость формирования и качество монослоя в зависимости от посевной концентрации клеток MARC-145 при использовании ДМЕМ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», n = 14
|
Концентрация клеток, тыс. в см3 |
Формирование монослоя, часы |
Визуальная оценка качества монослоя |
|
70 ± 10 |
95 ± 7,1 |
Неудовлетворительно |
|
100 ± 10 |
79 ± 2,0 |
Удовлетворительно |
|
150 ± 10 |
66 ± 2,3 |
Хорошо |
|
200 ± 10 |
34 ± 1,0 |
Хорошо |
|
250 ± 10 |
29 ± 3,1 |
Плотный монослой |
|
300 ± 10 |
26 ± 2,0 |
Плотный монослой с небольшим вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
350 ± 10 |
20 ± 0,51 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
400 ± 10 |
18 ± 1,2 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
Table 4
The rate of formation and quality of the monolayer depending on the seeding concentration of MARC-145 cells when using DMEM State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”, n = 14
|
The concentration of cells, thousand in cm3 |
Monolayer formation, hours |
Visual assessment of monolayer quality |
|
70 ± 10 |
95 ± 7.1 |
Unsatisfactorily |
|
100 ± 10 |
79 ± 2.0 |
Satisfactorily |
|
150 ± 10 |
66 ± 2.3 |
Good |
|
200 ± 10 |
34 ± 1.0 |
Good |
|
250 ± 10 |
29 ± 3.1 |
Dense monolayer |
|
300 ± 10 |
26 ± 2.0 |
Dense monolayer with slight cell elongation and surface growth |
|
350 ± 10 |
20 ± 0.51 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
|
400 ± 10 |
18 ± 1.2 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)
Так как изолят вируса оказался генетически стабильным, то он может быть рекомендован для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Этот изолят оказался продуктивным в культурах клеток МА-104 и Marc-145, прошел 15 пассажей, что имеет преимущество для репродукции вируса и получения антигена с целью дальнейшего изучения его молекулярно-генетических свойств.
