Постановка проблемы (Introduction)
Виноград является новой интродуцируемой культурой для условий восточной части Нечерноземной полосы Российской Федерации. Основной способ размножения винограда – черенкование одревесневшими и зелеными черенками. Однако данный способ является малопродуктивным и не может удовлетворить все возрастающий спрос на посадочный материал. К тому же производство посадочного материала высшей категории в России отсутствует [1, с. 12]. Для обеспечения качественным посадочным материалом актуально использование клонального микроразмножения.
Клональное микроразмножение является новым перспективным способом вегетативного размножения растений, позволяющим за короткое время получать генетически однородный посадочный материал в большом количестве от одного исходного растения [2, с. 37], [3, с. 45]. Данный метод размножения имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными: ускорение перехода растений от ювенильной фазы развития к репродуктивной; получение генетически однородного посадочного материала, освобождение растений от различного рода заболеваний, высокий коэффициент размножения, возможность проведения работ в течение всего года [4], [5, с. 6], [6, с. 151]. Растения, полученные методом клонального микроразмножения, проходя путь от меристематических клеток до взрослых растений, подвергаются процессу реювенилизации (омоложения), в результате чего лишаются действия накопившейся «усталости» [7, с. 94]. В промышленном производстве плодово-ягодных, садовых и декоративных культур во всем мире в настоящее время наиболее перспективным методом размножения растений считается метод in vitro [8, с. 581].
Методология и методы исследования (Methods)
Исследования проводились на базе лаборатории Отдела интродукции и акклиматизации растений УдмФИЦ УрО РАН. В работе пользовались общепринятыми в практике клонального микроразмножения растений методами: стерилизация исходного материала, введение в культуру, собственно клональное микроразмножение и укоренение in vitro с последующей адаптацией к условиям in vivo [4].
Цель исследования – совершенствование технологии размножения винограда культурного сорта Памяти Домбковской in vitro.
Объектом исследования были микрочеренки винограда культурного сорта Памяти Домбковской. В качестве исходного материала для введения в стерильную культуру in vitro были взяты верхушки интенсивно растущих зеленых побегов винограда, которые разрезали на одноглазковые черенки c удаленными листовыми пластинками и промывали под проточной водой в течение получаса. Стерилизацию растительного материала проводили 33-процентным раствором перекиси водорода с экспозицией 5–7 минут с последующим 5-кратным промыванием стерильным дистиллятом. В качестве первичных эксплантов использовали апикальные меристемы, выделенные в стерильных условиях ламинар-бокса при 10-кратном увеличении. Растительный материал культивировали в условиях светоустановки при температуре +25 °С и 16-часовом фотопериоде. Закладку опытов проводили в трехкратной повторности, в одной повторности не менее 10 пробирок. Статистическая обработка полученных данных была проведена дисперсионным методом по Б. А. Доспехову [9].
Исследовали следующие параметры: высота микропобегов и микросаженцев (мм, измеряли с помощью линейки), количество листьев (шт.), коэффициент пролиферации (шт/черенок, учитывали как количество микропобегов, полученных от одного черенка). Качество корней оценивали в баллах при осмотре (от 1 до 3 баллов). 1 балл – это слаборазвитая корневая система, имеющая один основной корень не более 20 мм или 2–3 более коротких, боковых корней нет; 2 балла – среднеразвитая корневая система, основных корней 3–4 длиной 20–50 мм или один, но с хорошо развитыми боковыми и всасывающими корнями; 3 балла – хорошо развитая корневая система, основных корней 5 и более длиной 20–50 мм, часто с хорошо развитыми боковыми и всасывающими корнями [10, с. 104]. Успешность адаптации рассматривали как процентное соотношение адаптированных микросаженцев к общему количеству высаженных в субстрат. На этапе адаптации была применена методика, разработанная и дополненная нами при клональном микроразмножении розы сорта Анжелика [11, с. 242].
Результаты (Results)
Успех размножения in vitro во многом зависит от состава питательных сред, на которых будет развиваться эксплант, микрочеренок и микрорастение на всех этапах культивирования. Для введения в культуру апикальных меристем использовали твердые агаризованные питательные среды Мурасиге и Скуга с пониженным содержанием макроэлементов и модифицированную среду МS по Зленко с соавторами, содержание цитокинина 6-БАП 0,25 мг/л [12, с. 21].
Приживаемость на среде с пониженным содержанием макроэлементов была существенно выше (40 %) по сравнению с модифицированной средой МS по Зленко с соавторами (30 % при НСР05 = 1,3).
Таким образом, оптимальной средой для введения в культуру винограда оказалась среда с пониженным содержанием макроэлементов. Полученные результаты согласуются с нашими предыдущими данными по введению в стерильную культуру четырех сортов винограда, где оптимальной питательной средой также была среда с пониженным содержанием макроэлементов [13, с. 176], [14, с. 159].
На этапе пролиферации с целью получения максимального количества микропобегов провели исследования по выявлению наиболее эффективной концентрации 6-БАП, изучены варианты (мг/л): 1,0 (К), 2,0 и 3,0, основа – модифицированная среда МS по Зленко с соавторами (с повышенным содержанием СаCl2 – 650 мг/л). Учитывали такие параметры, как коэффициент пролиферации, длина микропобегов, витрификация и некроз побегов (таблица 1).
Таблица 1
Влияние концентрации 6-БАП на морфометрические параметры микрочеренков винограда на этапе пролиферации, 2016–2017 гг.
|
Концентрация 6-БАП, мг/л |
Коэффициент пролиферации, шт/черенок |
Длина побега, мм., |
Витрификация, % |
Некроз, % |
|
1,0 (К) |
4,4 ± 0,7 |
17,6 ± 4,1 |
3,3 ± 3,3 |
26,7 ± 16,3 |
|
2,0 |
3,3 ± 0,8 |
13,3 ± 3,5 |
33,3 ± 4,2 |
40,0 ± 17,9 |
|
3,0 |
2,9 ± 0,9 |
11,4 ± 2,9 |
63,3 ± 3,3 |
13,3 ± 10,3 |
|
НСР05 |
1,0 |
4,2 |
10,5 |
17,9 |
Примечание: «±» – стандартное отклонение.
Table 1
Effect of 6-BAP concentration on morphometric parameters micro-transfers of grapes at the stage of proliferation, 2016–2017
|
Сoncentration of 6-BAP, mg/l |
The ratio of proliferation, pcs/cuttings |
The length of sprouts, mm |
Vitrification, % |
Necrosis, % |
|
1.0 (С) |
4.4 ± 0.7 |
17.6 ± 4.1 |
3.3 ± 3.3 |
26.7 ± 16.3 |
|
2.0 |
3.3 ± 0.8 |
13.3 ± 3.5 |
33.3 ± 4.2 |
40.0 ± 17.9 |
|
3.0 |
2.9 ± 0.9 |
11.4 ± 2.9 |
63.3 ± 3.3 |
13.3 ± 10.3 |
|
LSD05 |
1.0 |
4.2 |
10.5 |
17.9 |
Note: “±” is the standard deviation.
Как следует из данных, наиболее оптимальной для развития побегов была концентрация 6-БАП 1,0 мг/л, при которой был получен наибольший в опыте коэффициент пролиферации – 4,4 шт/черенок, на средах с содержанием цитокинина 2,0 и 3,0 мг/л данный показатель составлял соответственно 3,3 и 2,9 шт/черенок (при НСР05 = 1,0). Наши данные согласуются с результатами исследований, полученными Т. А. Красинской. При использовании 6-БАП в концентрациях 1,1, 1,5 и 2,0 мг/л отмечалось снижение коэффициента размножения с 4,4 до 3,8, а доля витрифицированных побегов, наоборот, возрастала с 1,8 до 29 % [15, с. 95]. Также среда МS с концентрацией 6-БАП 1,0 мг/л способствовала получению наилучших результатов по количеству побегов, длине побегов и количеству узлов. Для сорта Öküzgözü значения были 4,66, 1,24 и 6,39, сорта Boğazkere – 6,28, 1,15 и 6,81 соответственно [16, с. 55].
Синтетический цитокинин 6-БАП является универсальным, используется для размножения большого количества видов растений. По данным М. Монокари, при размножении Micrococca mercurialis (L.) Benth наибольший отклик (97 %) и количество побегов (4,2 побега/эксплант) наблюдали на среде МS, дополненной 1,0 мг/л 6-БАП [17, с. 39]. Для сортов роз плетистой группы Palais Royal, Camelot и Nahema на этапе пролиферации оптимальная концентрация цитокинина 6-БАП в составе питательной среды МS также была 1,0 мг/л [18, с. 385].
Средняя длина микропобега в контрольном варианте (1,0 мг/л) составляла 17,6 мм, что было существенно выше, чем на средах с цитокинином в концентрации 2,0 и 3,0 мг/л, где длина микропобегов была 13,3 и 11,4 мм соответственно (НСР05 = 4,2).
В контрольном варианте отмечали активный рост и формирование хорошо развитых боковых побегов. При дальнейшем увеличении концентрации 6-БАП до 3,0 мг/л наблюдали морфологические изменения побегов – некроз верхушки, признаки витрификации.
В контрольном варианте доля витрифицированных микрочеренков составляла 3,3 %, при увеличении концентрации цитокинина до 2,0 и 3,0 мг/л данный показатель был существенно выше – 33,3 и 63,3 % соответственно (НСР05 = 10,5). Применение высоких концентраций регулятора роста цитокинина приводит к появлению такого нежелательного эффекта, как витрификация.
Витрификация (гипергидрация, стекловидность) – морфологическое отклонение микрорастений, которые теряют способность размножаться и акклиматизироваться. В таких случаях нарушается образование хлорофилла, протеинов, снижается жизнеспособность и приживаемость при пересадке; большинство растений гибнет. Один из возможных путей уменьшения оводненности – снижение концентрации цитокининов в среде и температуры культивирования [19, с. 70].
Некроз верхушки – отмирание апикальных участков тканей с изменением их окраски. Наибольшее количество побегов с некрозом верхушки отмечено при концентрации 6-БАП 2,0 мг/л (40 %), в контрольном варианте таких растений оказалось 26,7 %, при увеличении концентрации цитокинина до 3 мг/л их доля уменьшалась до 13,3 %, но различия были не существенными. В асептической культуре отмершие верхушки побегов и кончики корней является визуальным признаком недостатка кальция [5, с. 57].
Таким образом, оптимальной для этапа собственно микроразмножения винограда сорта Памяти Домбковской оказалась питательная среда с содержанием цитокинина 6-БАП в концентрации 1,0 мг/л.
На этапе укоренения использовали две рецептуры питательных сред: МS c половинной концентрацией макроэлементов и модифицированную МS по Зленко с соавторами, содержание ауксина индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) 0,2 мг/л [20, с. 215]. Был проведен учет начала корнеобразования (рис. 1).
Рис. 1. Корнеобразование микрочеренков Vitis vinifera L., 2016–2017 гг.
Fig. 1. Root formation of Vitis vinifera L. micro-gears, 2016–2017
Через 12 дней культивирования на среде по прописи Зленко с соавторами укоренилось 75,0 % черенков, на среде ½ МS – 41,7 %, через 16 дней – 100,0 и 83,3 % соответственно. Максимальное количество черенков укоренилось через 14–16 дней культивирования на питательных средах.
На рис. 2 представлен внешний вид микросаженцев, пригодных для высадки на адаптацию в почвосмесь.
|
а) |
|
б) |
|
в) |
Рис. 2. Микросаженцы винограда сорта Памяти Домбковской перед высадкой на адаптацию. Продолжительность культивирования, дни:
а) 13; б) 33; в) 44
|
a) |
|
b) |
|
c) |
Fig. 2. Micro seedlings of the Pamyati Dombkovskoy grape variety before planting for adaptation. Duration of cultivation, days:
a) 13; b) 33; c) 44
По истечении 60 дней культивирования на питательной среде для укоренения учитывали такие параметры, как высота побега, количество листовых пластинок, развитие корневой системы (таблица 2).
Таблица 2
Морфометрические показатели микросаженцев винограда на этапе укоренения, 2016 г.
|
Питательная среда |
Высота побега, мм |
Количество листьев, штук |
Корневая система, баллы |
|
½ МС (К) |
54,6 ± 1,2 |
6,4 ± 0,1 |
2,4 ± 0,1 |
|
По Зленко и др. |
58,9 ± 1,9 |
6,9 ± 0,2 |
2,8 ± 0,1 |
|
НСР05 |
2,7 |
0,3 |
0,2 |
Примечание: «±» – стандартное отклонение.
Table 2
Morphometric indicators of grape microplants at the rooting stage, 2016
|
Nutrient medium |
The height of the escape, mm |
Number of leaves, pieces |
The root system, the points |
|
½ МS (С) |
54.6 ± 1.2 |
6.4 ± 0.1 |
2.4 ± 0.1 |
|
According to Zlenko and other |
58.9 ± 1.9 |
6.9 ± 0.2 |
2.8 ± 0.1 |
|
LSD05 |
2.7 |
0.3 |
0.2 |
Note: “± “ is the standard deviation.
Микросаженцы, выращенные на модифицированной среде MS по рецептуре Зленко с соавторами, имели значительно лучшие морфометрические показатели, такие как высота микропобегов, количество листьев и корневая система.
Адаптация растений-регенерантов к условиям in vivo является одним из самых ответственных и трудоемких этапов, который завершает весь процесс размножения in vitro. Для адаптации микросаженцев разными исследователями предложено множество вариантов почвосмесей. Нашими исследованиями по влиянию почвосмесей на успешность адаптации микросаженцев винограда и роз было выявлено, что лучшими являются субстраты, приготовленные на основе верхового торфа, обладающие оптимальным сочетанием агрофизических и химических свойств, в частности «Универсальная земля садовая» производства ЗАО «МНПП «ФАРТ».
Изначально адаптацию микросаженцев винограда после этапа укоренения проводили по методике, предложенной А. Б. Бургутиным (1991) в условиях пробирок [21, с. 220]. С тех пробирок, в которых микросаженцы достигали пробки, последние удаляли. Чтобы предотвратить появление плесени на агаризованной среде, 3–4 раза за 1,5–2 недели увлажняли поверхность агар-агара обычной водой. В конце этого периода верхушка растения и 1–2 развернутых листочка были вне пробирки. Посадку в почвенный субстрат проводили так, чтобы над поверхностью оставалась верхушка с 1–2 развернутыми листовыми пластинками. Однако данная схема укоренения микрочеренков, адаптации микросаженцев является продолжительной и трудоемкой, предполагает наличие теплицы.
Мы предлагаем начинать высадку на адаптацию саженцев винограда через 14 дней после посадки на укоренение, что позволяет сократить продолжительность нахождения черенков винограда на питательной среде в пробирке в 2–4 раза по сравнению с общепринятой методикой [22, с. 334].
После посадки черенков на питательную среду для укоренения уже через 10–14 дней культивирования корни достигают длины 10–15 мм без признаков ветвления. Надземная часть развита слабо: верхушечные черенки только начинают свой рост, на черенках из средней и нижней частей побега начинают просыпаться пазушные почки. По нашему мнению, очень важно уловить данный момент развития растений, так как относительно «старая» листовая поверхность в меньшей степени подвержена увяданию из-за потери тургора, корневая система справляется с влагообеспечением небольшой надземной части. Кроме этого, корни растений прямые, не загнуты, как это происходит при более длительном культивировании в условиях небольшого объема пробирок (рис. 2, б, в). Саженцы выборочно, аккуратно пинцетом вынимали из пробирок, корни промывали в децимолярном растворе марганцовокислого калия и высаживали в микропарник. На наш взгляд, промывание корней в растворе марганцовокислого калия от остатков агаризованной питательной среды в некоторой степени задерживает поражение пагубной микрофлорой.
Почвосмесь с посаженными саженцами проливали раствором «Триходерма вериде» согласно инструкции. «Триходерма вериде» относится к биологическим препаратам, представляет собой порошок, содержащий миллиарды сухих спор микрогрибка Trichoderma veride. Попадая во влажную и теплую среду (почву), они прорастают, размножаются и образуют невидимые глазу колонии. Этот вид грибка безвреден для растений, поскольку не питается их живыми тканями [23].
В предыдущих наших исследованиях было выявлено существенное увеличение количества адаптированных саженцев роз сорта Анжелика при внекорневой обработке препаратом «Силиплант» [11, с. 242]. Растения обильно однократно опрыскивали раствором «Силипланта» (1,5 мл/л). «Силиплант» – кремнийсодержащий препарат, в состав которого, кроме кремния (7 %) и калия (1 %), входят в легкодоступной для растений хелатной форме следующие микроэлементы: железо, медь, цинк, марганец, кобальт, бор. Удобрение разработано, зарегистрировано и производится ННПП «НЭСТ М». Препарат стимулирует развитие корневой и надземной частей, снимает различные стрессы, активирует фотосинтез. Усиливает механическую прочность клеточных стенок, обладает ярко выраженным фунгицидным действием, стерилизующим споры грибов. В дальнейшем влажность в микропарниках поддерживали путем ежедневного опрыскивания водопроводной водой саженцев и крышки микропарника из пульверизатора. При такой технологии адаптации нами была получена 100-процентная приживаемость микросаженцев винограда. После периода адаптации растения были высажены на доращивание в отдельные контейнеры.
Обсуждение и выводы (Discussion and conclusion)
Таким образом, на основании наших исследований по клональному микроразмножению Vitis vinifera L. сорта Памяти Домбковской можно сделать следующие выводы:
1. Оптимальной средой для введения в культуру винограда является среда Мурасиге и Скуга с пониженным содержанием макроэлементов (приживаемость эксплантов – 40 %).
2. На этапе микроразмножения для роста и развития побегов целесообразно использовать питательную среду с содержанием цитокинина 6-БАП в концентрации 1,0 мг/л.
3. Питательная среда для укоренения по рецептуре Зленко с соавторами способствует лучшему развитию микрорастений.
4. С целью повышения эффективности клонального микроразмножения выведение на адаптацию пробирочных растений следует производить через две недели культивирования in vitro на среде для укоренения, что позволяет сократить продолжительность ризогенеза в 2–4 раза по сравнению с общепринятой методикой с сохранением высокой приживаемости растений (до 100 %).
