The article is devoted to an experimental study to determine the toxicological safety profile of the anti-tuberculosis drug "Rifabutin" when administered once to linear and nonlinear animals (mice, rats, rabbits)
rifabutin, toxicity, average lethal dose, comparison sample, lethality, safety profile of the drug
Более чем полувековой опыт применения инъекционных лекарственных форм противотуберкулезных препаратов позволяет отнести такой прием введения к весьма целесообразным в силу контролируемости лечения, повышения биодоступности и сокращения сроков бациллоносительства. Химиотерапия туберкулеза препаратами рифамицинового ряда началась именно с инъекционных лекарственных средств, поэтому продвижение на рынок растворимой формы Рифабутина для внутривенного введения кажется вполне естественным, если учесть и, то обстоятельство, что Рифабутин эффективен при полирезистентном туберкулезе легких [1].
Рисунок 1 – 11,4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-51-(2-метилпропил)-1-оксорифа-мицин XIV
Полусинтетический антибиотик группы рифамицина (рисунок 1). Красно-фиолетовый порошок, практически нерастворимый в воде, однако в лиофилизированной форме при добавлении воды образует устойчивую коллоидную систему без осадка и видимых агломератов, запаха не имеет. Предназначен для лечения инфекций, вызванных микобактериями туберкулеза и атипичными бактериями, причем на фоне иммунодепрессии, а также туберкулеза, вызванного рифамицинорезистентными штаммами.
В связи с преимущественным применением Рифабутина в составе комбинированных препаратов [2, 3] отчетливой определенности в побочных эффектах, вызываемых именно Рифабутином, в литературе не приводится, тем не менее, указывается на возможность расстройств пищеварительной системы: тошнота, рвота, повышение содержания в сыворотке крови печеночных ферментов, желтуха; на кровь и кроветворение: лейкопения, тромбоцитопения, анемия; на опорно–двигательный аппарат: артралгия, миалгия; на орган зрения: обратимый увеит. Возможны аллергические и иммунопатологические реакции: сыпь, бронхоспазм, анафилактический шок. Вышеотмеченные побочные эффекты свойственны лекарственной форме Рифабутина в капсулах, для растворимой формы препарата в доступной литературе данных нет, найдена лишь отрывочная информация об отсутствии эффекта раздражения слизистой желудочно–кишечного тракта при внутривенном введении Рифабутина в отличие от перорального (в виде капсул) [4].
Внутрь Рифабутин назначают один раз в сутки в дозе 300 мг (4,3 мг/кг), в комбинации – 450–600 мг, на срок 6 месяцев. Режим введения растворимого препарата внутривенно в литературе еще не представлен, но, по-видимому, терапевтическая доза будет втрое меньшей – 1,4 мг/кг, т.к. многие активные химические соединения при парентеральном введении по токсическому эффекту, в отличие от внутрижелудочного, соотносятся именно таким образом. Эту же дозу – 1,4 мг/кг сочтено целесообразным выбрать и для данного токсикологического исследования. Ожидаемая токсическая доза – 50 мг/кг, а промежуточная – 5 мг/кг. По-видимому, и длительность лечения пациентов растворимой лекарственной формой препарата будет иной. В условиях эксперимента на животных, возможно ограничиться 12 сутками ежедневных введений кроликам. Сведения о рифабутине в доступной литературе ограничены, поскольку рифабутин чаще встречается в составе комбинированных препаратов, однако некоторые сведения о токсичности рифабутина представлены в некоторых источниках информации [7, 8]. Установление параметров острой токсичности при внутрибрюшинном введении растворимой формы Рифабутина осуществлялось с использованием мышей линии ВАLВ/с и нелинейных, а также крыс линии Вистар и нелинейных. В качестве модели многократного внутривенного воздействия той же формой Рифабутина использованы кролики серой масти (самцы и самки отдельно). В процессе установления параметров острой токсичности при внутрибрюшинном введении растворимой формы Рифабутина учитывалось время наступления гибели животных, характер клинических проявлений острой интоксикации, у погибших и выживших – морфология внутренних органов. Производился расчет среднесмертельной дозы. В экспериментах использованы мыши и крысы.
В условиях установления параметров острой токсичности [5, 6] растворимая форма Рифабутина вводилась мышам и крысам внутрибрюшинно в виде устойчивой коллоидной системы (растворитель – вода для инъекций) в диапазоне доз от 1000 мг/кг до 2500 мг/кг. Способ растворения рекомендован изготовителем: серии с содержанием Рифабутина во флаконе 56,4 мг; 52,1; 54,7; 57,6; 57,3 растворяли в 10 мл воды; с содержанием 23,3 мг – в 4 мл воды. Исходя из полученного объема производили расчет доз. Дозирование проводили по активному веществу. Объемы вводимого раствора составили: от 1 мл до 3,1 мл/мышь и от 5 до 11 мл/крыса. В условиях многократного внутривенного введения кроликам были выбраны следующие дозы: 50 мг/кг; 5 мг/кг; 1,4 мг/кг. Срок введения: 12 дней ежедневно. Обследование животных на 1,3,7,11 сутки. Морфология на 12 сутки с усыплением животных.
Растворимая форма Рифабутина для внутривенного введения (образец РБ – 687). Активное вещество – Рифабутин. Внешний вид: лиофилизат для приготовления раствора. Цвет: от розового с фиолетовым оттенком до темно-фиолетового. Запах: без запаха. Размер частиц при разбавлении в 50 раз – 13,5 ± 0,4 нм. Растворимость – при добавлении воды образует устойчивую коллоидную систему без осадка и видимых агломератов. Препарат сравнения – Рифабутин, капсулы, 150 мг, производства «Люпин ЛТД» (Индия). Подлинность подтверждена ВЭЖХ. Манипуляции с препаратами выполнялись в соответствии со стандартными утвержденными правилами.
Для установления параметров острой токсичности препарат в виде свежеприготовленной коллоидной системы вводили мышам и крысам внутрибрюшинно.
При совпадении максимально допустимого объема введения и испытуемых доз препарата проводили расчет средних смертельных доз. Дозирование проводили по активному компоненту. В полной мере получить параметры острой токсичности удалось только на мышах, как линии ВАLВ/с, так и нелинейных. Было принято решение ввести препарат и крысам, даже и в недопустимом объеме, с тем чтобы попытаться выявить органы–мишени морфологическими приемами.
ЛД50 = 1567 ± 150 мг/кг (мыши–самцы ВАLВ/с);
ЛД50 = 1500 ± 150 мг/кг (мыши–самки ВАLВ/с);
ЛД50 = 1633 ± 150 мг/кг (нелинейные мыши–самцы);
ЛД50 = 1567 ± 150 мг/кг (нелинейные мыши–самки).
Принципиальных отличий между линейными и нелинейными животными, между самцами и самками не установлено.
Параметров острой токсичности на крысах установить не удалось из-за необходимости введения значительного количества объема жидкости в полость брюшины, однако было принято решение выполнить эксперимент с использованием крыс для установления характера возможного токсического действия Рифабутина с учетом стрессового эффекта (таблица 1).
Таблица 1
Летальность крыс-самцов линии Вистар при внутрибрюшинном введении растворимой формы Рифабутина в различных дозах (масса тела 235–240 г)
|
Доза, мг/кг |
500 |
800 |
1100 |
|
«–» гибели нет*, «+» гибель есть* |
– |
+ |
+ |
Примечание. *-при объеме введения 9,5–10 мл жидкости внутрибрюшинно
Использование животных с минимальной допустимой массой – 150 г позволило снизить объем вводимой жидкости до 6,2 мл, что существенно не повлияло на летальность крыс. Сохранилась и прежняя клиника острого отравления. Введение капсульной формы Рифабутина крысам внутрижелудочно (в дозах 3000–5000 мг/кг дискретно – в два приема с интервалом в 2 часа) дали возможность получить диапазон доз, пригодных для расчета DL50, и использовать классификацию для оценки степени токсичности (таблица 2).
Эксперимент позволил определить ЛД50 = 2917± 217 мг/кг (крысы-самцы линии Вистар). В результате проведенных экспериментов, как с использованием мышей, так и крыс, удалось выявить характерные проявления острой токсичности растворимой формы Рифабутина: через 30–40 мин от времени введения препарата резко снижалась двигательная активность, появлялась одышка (при допустимом и недопустимом введении жидкости, кстати при введении в полость брюшины физраствора даже в количестве 23 мл на крысу одышка не возникала). Через 1,5–2 часа у животных (как линии Вистар, так и у нелинейных) появлялась шаткая походка, некоторые животные принимали боковое положение и погибали от остановки дыхания в течение первых суток (доза 2500 мг/кг). У животных, переживших этот период, в течение последующих двух суток оставалась характерная поза, затем наступало постепенное восстановление общего состояния – животные начинали принимать корм и воду.
Таблица 2
Степень токсичности (по Hodge и Sterner)
|
Степень токсич-ности |
Оценочное понятие |
ЛД50 однократно, через рот, крысы (мг/кг) |
|
1 |
Чрезвычайно токсично |
<1 |
|
2 |
Высокотоксично |
1–50 |
|
3 |
Умеренно токсично |
50–500 |
|
4 |
Малотоксично |
500–5000 |
|
5 |
Практически нетоксично |
5000–15000 |
|
6 |
Относительно безвредно |
>15000 |
При внутрижелудочном введении Рифабутина в капсульной форме гибель животных наступала после поступления в организм препарата в диапазоне доз от 2000 до 5000 мг/кг при сходной клинической картине интоксикации, как правило, на 1–2 сутки. При нанесении на конъюнктиву глаза кроликов коллоидной системы из расчета 58,2 мг в 10 мл воды никаких признаков раздражения слизистой не обнаружено ни в ранние сроки после аппликации, ни в последующие (в течение 14 дней). При нанесении на конъюнктиву глаза нерастворимой формы Рифабутина (в виде содержимого капсулы) через 20–30 мин – инъекция сосудов без отека, со слезотечением продолжающимся 1–1,5 часа. Восстановление наступало в течение первых суток без морфологических последствий. Закапывание на конъюнктиву отфильтрованной взвеси – 0,3 мл в концентрации 100 г/л вызвало инъекцию сосудов до 2 баллов без выраженного слезотечения. Восстановление наступало в течение первых суток.
Экспериментальные исследования показали, что при совпадении максимально допустимого объема внутрибрюшинного введения и испытуемых доз растворимой формы Рифабутина мышам среднесмертельная доза составила 1567 ± 150 мг/кг (самцы) и 1500 ± 150 мг/кг (самки). Добиться аналогичного совпадения на крысах, к сожалению, не удалось, однако по клинике острого отравления, да и по ожидаемому уровню летальности, результаты, в целом, совпадают, что позволяет отнести растворимую форму Рифабутина к пятой степени токсичности (практически нетоксичные), учитывая то, что степень токсичности при введении многих химических веществ в желудок, по сравнению с внутрибрюшинным, как правило, в три раза ниже. Внутрижелудочное введение крысам капсульной формы препарата в нарастающих дозах дало возможность получить среднесмертельную – 2917 ± 217 мг/кг (четвертая степень – малотоксичные, по классификации опасности – 3 класс – умеренно опасные). При введении в высоких дозах (выше 600 мг/кг) клиника отравления развивается быстро: уже через 20–30 мин. наступает угнетение двигательной активности, одышка, крысы принимают характерную позу. Гибель наступает в течение первых двух суток – на вскрытии нарушение гемодинамики, парез кишечника. У выживших животных через 3–5 суток явления интоксикации в значительной степени исчезают, но у некоторых крыс еще в течение последующей недели сохраняется снижение двигательной активности, снижение прироста массы тела. Препарат в дозах ниже 300 мг/кг практически не вызвал у крыс и мышей явлений ответной реакции на воздействие.
Не отмечено и признаков раздражения тканей, как в месте введения препарата, так и слизистых, в отличие от капсульной формы, вызывающей деструкцию эпителия желудка при внутрижелудочном введении крысам и кроликам, что подтверждено и морфологически. Результаты исследования однократного воздействия растворимой формой Рифабутина при его внутрибрюшинном введении позволили отнести препарат к приемлемо переносимым в дозах ниже 300 мг/кг и сделать заключение о малотоксичности препарата.
1. Usov, K.I. Sovremennaya farmakoterapiya tuberkuleza legkih s mnozhestvennoy lekarstvennoy ustoychivost'yu / K. I. Usov // Sovremennye tehnologii i nauchno-tehnicheskiy progress. – 2022. – № 9. – S. 285-286.
2. Usov, K.I. O nedostatkah sovre-mennyh kombinirovannyh protivotuberkuleznyh preparatov / K. I. Usov // Sovremennye tehnologii i nauchno-tehnicheskiy progress. – 2022. – № 9. – S. 281-282.
3. K probleme eksperimental'nogo toksikologicheskogo issledovaniya sovremennyh kombinirovannyh protivotuberkuleznyh preparatov / K. I. Usov, G. G. Yushkov, T. M. Filippova, V. V. Benemanskiy // IV S'ezd toksikologov Rossii : Sbornik trudov, Moskva, 06–08 noyabrya 2013 goda / Pod redakciey G.G.Onischenko i B.A.Kurlyandskiy. – Mo-skva: Rossiyskiy registr potencial'no opasnyh himicheskih i biologicheskih ve-schestv, 2013. – S. 491-493.
4. Usov, K.I. Razrabotka novyh podhodov k snizheniyu nezhelatel'nyh pobochnyh effektov protivotuberkuleznyh preparatov / K. I. Usov, T. A. Gus'kova, K. A. Dudareva // Perspektivy razvitiya biomedicinskih tehnologiy v Baykal'skom regione: sbornik tezisov Mezhdunarodnoy nauchnoy konferencii, Irkutsk, 05–07 fevralya 2019 goda. – Irkutsk: Institut geografii im. V.B. Sochavy Sibirskogo otdeleniya Rossiyskoy akademii nauk, 2019. – S. 108-113.
5. Usov, K.I. Ostraya toksichnost' protivotuberkuleznyh preparatov, soder-zhaschih i ne soderzhaschih piridoksina gidrohlorid (eksperimental'noe issledovanie) / K. I. Usov, G. G. Yushkov, A. V. Mashanov // Tuberkulez i bolezni legkih. – 2014. – № 12. – S. 76-82.
6. Usov, K.I. Antioksidantnye ef-fekty ademetionina pri vvedenii krysam protivotuberkuleznyh preparatov v toksicheskih dozah / K. I. Usov, T. A. Gus'kova, G. G. Yushkov // Toksikologicheskiy vestnik. – 2019. – № 6(159). – S. 28-32.
7. Bruglera M., Scampini Q., Newman A. et all. Overview of toxicological data on rifabutin / Exp.Toxicol Pathol, 1995 jan:47(1): R.1–9.
8. Furet J. Hepatite mixte a la rifamycine SV. A propos d'un CAS // Therapie. –1986 –Vol.41, №5.–R.405–406.
