The Potato spindle tuber viroid infects potato plants, causing a serious damage to agriculture by reducing yields. Therefore, there is a need to identify this pathogen. Viroids are RNA molecules and so cannot be detected with the immunological methods and the classical PCR. The aim of this work is to develop a method for detection of the Potato spindle tuber viroid. Primers have been selected for the reverse transcription reaction and the subsequent PCR, the annealing temperatures and the size of the amplified fragment have been calculated. Primers and reaction conditions have been tested on plant material. PCR products of the calculated size have been obtained. Determination of their nucleotide sequence confirmed the identification of the genetic material of the Potato spindle tuber viroid. Thus, this PCR test system can be used for detection of the Potato viroid and become the basis for detection of other vegetable crops’ viroids.
Potato spindle tuber viroid, PSTVd, PCR-test system
Введение
Болезнь картофеля “веретеновидность клубней”, получившая название из-за характерного симптома – удлиненной формы клубней, впервые была описана в США в 1922 г. В СССР заболевание впервые отмечено на Украине в 1937 г. [1]. Возбудителем оказался представитель неизвестного ранее класса патогенов, названного позднее вироидами (т.е. «вирусоподобный»).
Вироиды – ковалентно замкнутые, очень короткие кольцевые одноцепочечные молекулы РНК. Вироиды лишены белковой оболочки и не кодируют никакого белка. По причине простоты своего строения они выработали способы использовать исключительно клеточные белки для поддержания своего существования. Реплицируются вироиды полностью за счет ферментов растения-хозяина [2, 3].
Вироид веретеновидности клубней картофеля (ВВКК; род Pospiviroid) – первый в череде открытых в дальнейшем вироидов.
Ярко выраженные типичные симптомы поражения: появление деформированных листьев (морщинистость, скручивание), отставание в росте и даже карликовость, появление клубней веретеновидной, грушевидной или гантелеобразной форм, с выпуклыми глазками и выраженными “бровями” и/или трещинами, усиленное образование плодов, из которых лишь немногие созревают [4]. При заражении ВВКК в растении отмечаются значительные физиологические и биохимические изменения, что приводит, как правило, к снижению продуктивности картофеля. Данное явление происходит за счет уменьшения массы одного клубня и количества клубней на одно растение, однако структура урожая изменяется в меньшей степени, чем его величина. Уменьшение продуктивности зависит от длительности культивирования инфицированного картофеля, сорта, изолята (штамма) ВВКК, агротехники и др. и может колебаться от 20–30 до 90–100 % [5].
В конце 1980-х и начале 1990-х гг. вироидная инфекция картофеля стала широко распространенным явлением в России, особенно в Центральном и Северо-Западном регионах, а также на Дальнем Востоке [5]. Это нетипичное событие, поскольку вироидные болезни прежде наблюдались в регионах с более теплыми и сухими погодными условиями, а в Центральном регионе заражение картофеля ВВКК обычно не превышало 5 %. В настоящее время вироид – распространенный патоген, вредоносность которого возрастает в случае массового инфицирования картофеля, особенно при последующих репродукциях [6].
Таким образом, возникает необходимость выявления данного патогена в посадочном материале для контроля его распространения. Однако вироид представляет собой молекулу РНК, а не ДНК, следовательно, стандартный метод полимеразной цепной реакции не подходит. С другой стороны, РНК вироида не связана с белками, соответственно, иммунологические методы, хорошо зарекомендовавшие себя при выявлении вирусов, также не подходят [7].
Следовательно, цель данной работы – разработка метода выявления РНК вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК или PSTVd) методом обратной транскрипции с полимеразной цепной реакцией.
Материалы и методы
Последовательности геномов вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК или PSTVd) были скопированы из базы данных Genome, или Nucleotide www.ncbi.nlm.nih.gov. Названия последовательностей и их паспортные номера представлены в табл. 1.
В качестве источника нуклеиновых кислот использовались пазушные почки клубня картофеля и покровная ткань вокруг них. Суммарные нуклеиновые кислоты выделялись с помощью модификации гуанидинтиоизоцианатного метода [8].
Реакцию обратной транскипции проводили следующим образом: 50 нг РНК в 4 мкл воды добавляли по 1 мкл обратного праймера в концентрации 40 рМ/мкл, прогревали при 95 0С 5 мин, затем добавляли 1 мкл 10Х буфера для обратной транскрипции, 1 мкл смеси dNTPs (концентрация 4 мкМ), 1 мкл обратной транскриптазы MMLV (15 е.а/мкл) (Сибэнзим) и воду до 10 мкл. Полученную смесь инкубирвали при 37 0С 1 ч 10 мин. Затем переосаждали и вносили на реакцию ПЦР: 2 мкл раствора матрицы и обратной транскрипции, 1 мкл буфера, 0,5 мкл смеси dNTPs (концентрация 4 мкМ), по 1 мкл праймеров концентрация каждого 10 рМ/мкл, 0,75 мкл Taq-полимеразы (5 ед.а./мкл) (Сибэнзим) и воду до 10 мкл. Полимеразную цепную реакцию проводили в следующих условиях: 1 цикл 95 0С – 5 мин, 35 циклов по 95 0С –
30 сек, 42 0С – 30 сек, 72 0С – 30 сек, 1 цикл 72 0С – 8 мин. Продукты амплификации разделялись в 6 %-ном нативном полиакриламидном геле, который окрашивался бромистым этидием [8].
ПЦР продукты экстрагировали из геля [8] и определяли нуклеотидную последовательность в фирме Евроген.
Результаты и их обсуждение
Вироид, вызывающий веретеновидность клубней картофеля, с одной стороны, вызывает серьезные уменьшения урожайности картофеля, с другой – не имеет в своей структуре белка, что не дает возможности использовать иммунологические методы, с третьей стороны, в качестве генетического материала у данного возбудителя является РНК, следовательно, нет возможности использовать стандартные методы ПЦР. Именно поэтому был выбран метод обратной транскрипции, совмещенной с полимеразной цепной реакцией.
Выбрано 15 последовательностей изолятов вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК или PSTVd) в базе данных www.ncbi.nlm.nih.gov, результаты представлены в табл. 1.
Далее последовательности проанализированы в программе AliBee - Multiple alignment Release 3.0 на сайте http://www.genebee.msu.su/genebee.html. В выявленных консервативных участках отбирали фрагменты 20–25 нуклеотидов, начинающихся и заканчивающихся на гуанин или цитозин (предполагаемые праймеры). Затем проверяли их температуру отжига и уникальность в программе nucleotide blast www.ncbi.nlm.nih.gov, с присвоением номеров от 0 – последовательность не выявляется в нужных видах и генах, до 10 – последовательность выявляется только в геномах вироидов веретеновидности клубней картофеля и больше нигде.
Из табл. 2 были выбраны уникальные праймеры с одинаковыми температурами отжига и вручную рассчитан размер ожидаемого ампликона. Эти праймеры представлены в табл. 3 вместе с размером ожидаемого ампликона (ПЦР продукта). Данные праймеры представлены в табл. 3, там же указан размер ПЦР продукта, который составил 273 п.н.
Выбраны последовательности для праймеров № 4 и № 11 из табл. 2, их температура отжига различалась всего на 1 0С, причем уникальность во всех случаях составляла 10 пунктов по шкале уникальности, т.е. данные фрагменты выявляются только в последовательностях вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК или PSTVd). Далее праймеры были заказаны в фирме Синтол. Для анализа использованы образцы пазушных почек клубней картофеля, так как растущие ткани более пригодны для выделения ДНК как ткани с меньшим размером клеточных стенок и большим объемом генетического материала. Клубни предоставлены с фермерского поля в Куменском районе Кировской области.
Было выбрано восемь клубней с прорастающими пазушными почками, из которых брался материал для обратной транскрипции и ПЦР. Полученный результат представлен на рис. 1. Как видно из фотографии, положительными были образцы № 1 и № 6. В отрицательном контроле полосы продуктов отсутствуют, что свидетельствует о чистоте реактивов, а также о невзаимодействии праймеров между собой в процессе амплификации. Наличие дополнительной полосы длиной меньше 100 п. н. указывает на неспецифический отжиг в геноме вироида, но не в геноме растения-хозяина. Если бы отжиг происходил в ДНК картофеля, полоса бы присутствовала во всех образцах. В образце № 1 полоса слабее – это связано с меньшим количеством материала для амплификации, в образце № 6 полоса достаточно яркая.
ПЦР продукты были амплифицированы с образцов № 1 и № 6, выделены из геля и отправлены на определение нуклеотидной последовательности, проводили автоматически в компании Евроген.
Получена данная последовательность нуклеотидов: TCTCGGGAGCTTCAGTTGTTTCCACCTGTTTCCCTTAAAGGTCTCGGGAGGTCAGGTGTAACCACAGGAAC. Она короче, чем размер ПЦР продукта, так как секвенирование ПЦР продуктов затруднено, поэтому был переведен в текстовый редактор только тот участок, в котором были наиболее точные результаты капиллярного гель-электрофореза.
Полученная последовательность проанализирована в Nucleotide blast www.ncbi.nlm.nih.gov. Результаты представлены на рис. 2.
В итоге было доказано, что данная последовательность относится к вироидам веретеновидности клубней картофеля (ВВКК или PSTVd) с вероятностью 100 %.
Заключение
Вироид веретеновидности клубней картофеля (ВВКК, или PSTVd) наносит существенный урон урожайности картофеля. Нами разработана и успешно используется ПЦР-тест система для точного выявления генетического материала данного возбудителя в растениях.
1. Cordingley, M.G. Viruses agents of evolutionary invention / G. Michael Cordingley. — Harvard: Harvard Univ. Press, 2019. — 400 p.
2. Hammond, R.W. Viroids: new and continuing risks for horticultural and agricultural crops/ R.W. Hammond, A.R. Owens // APSnet Features. – 2006.
3. Gnutova, R.V. Virusnyye i viroidnyye bolezni kartofelya na Dal’nem Vostoke i metody ikh diagnostiki v semenovodstve [Viral and viroid diseases of potato in the Far East and methods of their diagnostics in seed production] / R.V. Gnutova, K.A. Mozhayeva // Izvestia TSKhA [Journal “News of the Timiryazev Agricultural Academy”]. – 2010. Vol. 2. – № 62. – P. 35–43.
4. Moskalev, A.V. Biologicheskiye effekty viroidov [Biological effects of viroids] / A.V. Moskalev //Vestnik ossiyskoy voyenno-meditsinskoy akademii [Bulletin of the Russian Military Medical Academy]. – 2018. Vol. 2. – № 62. – P. 209–214.
5. Mozhayeva, K.A. Produktivnost’ kartofelya, infitsirovannogo viroidom veretenovidnosti klubney kartofelya [Productivity of potatoes infected with the Potato spindle tuber viroid] / K.A. Mozhayeva //Izvestiya TSKHA [Journal “News of the Timiryazev Agricultural Academy”]. – 2011. – № 6. – P. 60-68.
6. Mehle, N. Survival and transmission of Potato virus Y, Pepino mosaic virus, and the Potato spindle tuber viroid in water / N. Mehle [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. 2014. – Vol. 80 (4). – R. 1455–1462.
7. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, T. Fritch, T. Maniatis. – NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. – 1626 p.
