Введение
Нормирование загрязнений водоемов поллютантами промышленного происхождения является актуальным направлением исследований по всему миру. В настоящий момент имеется большое количество данных о действии различных поллютантов, встречающихся в водных экосистемах, на организмы разного трофического уровня [1]. Среди наиболее распространенных промышленных загрязнителей естественных водоемов можно выделить тяжелые металлы, нефть и продукты ее переработки, поверхностно-активные вещества, а также мелкие частицы пластика (микропластик) и продукты их разложения [2]. Ввиду хронического действия некоторые вещества могут оказывать негативное влияние на водные организмы даже в низких концентрациях, например, аккумулируясь в организмах и/или взаимодействуя
с другими токсическими соединениями.
Эндокринно-деструктивные вещества (ЭДВ) – это группа химических веществ, широко распространенных в окружающей среде, способных к аккумуляции и нарушению функции эндокринной системы [3]. Бисфенол А (БФА) является одним из представителей ЭДВ и относится к группе фенольных соединений [4]. Негативное влияние БФА на эндокринную систему обусловлено его структурной гомологией с 17β-эстрадиолом, что позволяет ему прочно связываться с рецепторами эстрогенов и гамма-рецепторами, связанными с эстрогенами у позвоночных животных [5]. Во множестве работ на рыбах было показано, что БФА приводит к нарушению репродуктивной функции [6], обладает тератогенным и генотоксическим действием [6, 7] и может приводить к отклонениям в работе антиоксидантных систем организма [8]. В водную среду БФА попадает через сточные воды очистных сооружений, промышленные стоки нефтехимических производств и фильтраты свалок [9]. При этом его концентрация в естественных водоемах может варьировать от 1–10 до 1 720 мкг/л [10].
Оценка действия поллютантов на водные организмы подразумевает использование нескольких биомаркеров, что позволяет установить пороговые и недействующие концентрации, а также выявить предполагаемый механизм действия [11]. Поведение рыб является важным показателем при оценке экологических рисков, т. к. позволяет соотнести физиологические функции организма с экологическими процессами в водоеме [12]. Развитие автоматических средств для оценки поведения привело к появлению множества этологических тестов, позволяющих изучить влияние изучаемого фактора на локомоторную активность, тревожность, групповое поведение, реакцию на хищника и многое другое [13–15]. Подобные исследования крайне удобно проводить на лабораторных видах рыб (например, Danio rerio, Oryzias latipes), которые отличаются небольшими размерами и изученными этологическими реакциями. В частности, было показано, что БФА в концентрациях, обнаруживаемых в окружающей среде, приводит к неравномерному характеру плавания, изменению активности и скорости плавания, а также повышению агрессии у рыб [8, 16, 17], при этом до настоящего времени не проводилась оценка острого действия БФА в сублетальных концентрациях на локомоторную активность рыб. Важно отметить, что острая и хроническая токсичность вещества могут значительно различаться, однако данные по краткосрочным эффектам низких концентраций и долгосрочные последствия высоких концентраций одинаково важны для системного понимания механизмов воздействия поллютанта.
Таким образом, целью исследования является оценка острого действия бисфенола А на поведенческие признаки и локомоторную активность Danio rerio с использованием теста открытого пространства.
Материалы и методы
Danio rerio (дикий тип) возрастом 4–5 месяцев содержались в аквариумах объемом 300 л по 200 особей в каждом с системами механической и биологической фильтрации и подменой 10 % объема воды в сутки. Содержание и уход за рыбами производился согласно рекомендациям Westerfield [18]. До начала опыта рыбы получали корм Tetra Min Flakes XL (Melle, Germany). Температура (24 °C), режим ос-
вещенности (12 : 12 ч) и гидрохимические параметры (pH 7,3 ± 0,3; EC 500 мкS, O2 7,9 ± 0,2 мг/л; NH4 < < 0,05 мг/л; NO2 0,15 ± 0,02 мг/л; NO3 3,1 ± 0,9 мг/л) в опытных аквариумах на начало острого опыта соответствовали аквариумам содержания. Для исследования отбирались особи обоих полов без видимых повреждений со средним размером 2,12 ± 0,3 см и массой 0,29 ± 0,03 г. По ходу острого опыта проводился контроль смертности рыб, изменений поведения и появления клинических нарушений.
Диапазон концентраций БФА (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) для острого опыта включал следующие концентрации: 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 12,0, 16,0 и 20,0 мг/л. Для приготовления маточного раствора БФА использовался диметилсульфоксид (DMSO) в качестве стандартного растворителя в концентрации 1 % (v/v), согласно данным других авторов [19]. В контрольной группе рыбы подвергались действию только DMSO. Длительность экспозиции составила 96 ч. Подробное описание экспериментов и результаты оценки острой токсичности БФА на выживаемость, гистологические и гематологические показатели приведены в работе [7].
Для оценки локомоторной активности и тревожности данио при остром действии БФА использовался тест отрытого пространства c некоторыми модификациями. Известно, что данио проявляют отторжение к ярко освещенным и открытым пространствам, но при этом имеют естественное стремление к исследованию новой среды [13]. Таким образом, в тесте открытого пространства избегание центра арены и замирание (скорость <0,1 см/с) трактуется как тревожное поведение [20].
Для проведения теста использовалась круглая стеклянная емкость диаметром 60 см и высотой 10 см, окрашенная с внешней стороны в белый цвет. В качестве параметров, характеризующих тревожность и локомоторную активность рыбы, использовали время нахождения в центральном круге/внешнем кольце емкости (с), время бездействия (с), дистанцию (см) и скорость движения (см/с). Данные параметры измерялись отдельно в двух частях емкости: внешнее кольцо шириной 10 см и внутренний круг диаметром 40 см. Съемка поведения производилась с использованием веб-камеры C920 HD PRO (Logitec, Швейцария), расположенной перпендикулярно над емкостью. В качестве источника света использовали студийный диодный кольцевой осветитель RL-0518 Kit (Raylab, Россия) с цветовой температурой, равной 4 200 К, и освещенностью 1 000 лк. Оценка поведения проводилась в отдельном помещении с минимизацией дневного освещения и звукоизоляцией [21]. Исследование поведения производилось сразу после завершения острой экспозиции. Для оценки поведения из каждой группы случайно отбиралось по 5 особей, которые переносились в тестовое помещение партиями и акклиматизировались
в течение 30 мин [15]. Далее рыба переносилась в центральную часть емкости для тестирования, где 1 мин уделялась для акклиматизации и 5 мин для съемки поведения (300 с). После завершения тестирования рыба переносилась в отдельную емкость, вода в емкости для тестирования заменялась на новую, и процедура повторялась вновь для следующей группы [13].
Для первоначальной обработки видеофайлов (уменьшение частоты кадров, корректировка контрастности) применялись возможности программы Avidemux. С целью автоматического отслеживания движения рыбы и расчета параметров поведения использовали плагин AnimalTracker [22] для программы Fiji ImageJ2 [23].
Данные сравнения анализируемых переменных представлены в виде средних ±SD. Статистическая достоверность определялась с использованием непараметрических тестов (тест Крускала – Уоллиса, U-тест Манна – Уитни) и параметрических тестов (односторонняя ANOVA с последующим тестом Тьюки) в зависимости от распределения данных и однородности вариаций (тесты Шапиро – Уилка
и Левена). Значение p < 0,05 было принято как статистически достоверное. Для выявления зависимости концентрация-эффект применялся регрессионный анализ с использованием корреляции Пирсона. Обработка статистических данных производилась с использованием GraphPad Prism version 9.0 software (GraphPad, San Diego, CA, USA) и R software (v3.5.2)/RStudio.
Результаты
При остром действии БФА изменение поведения наблюдалось в опытных аквариумах, в которых происходила экспозиция (табл. 1).
Таблица 1
Table 1
Качественная оценка изменений поведенческих и клинических признаков Danio rerio,
подвергавшихся острому воздействию бисфенола А*
Qualitative assessment of changes in the behavioral and clinical signs of Danio rerio
exposed to acute exposure to bisphenol A
|
Концентрация, мг/л |
Баланс |
Гиперактивность |
Движение |
Заглатывание воздуха, оперкулярные движения |
|
Контроль |
+++ |
++ |
+++ |
+ |
|
0,5 |
+++ |
+ |
+++ |
+ |
|
1 |
+++ |
+ |
++ |
++ |
|
2 |
++ |
+ |
++ |
+ |
|
4 |
++ |
++ |
+++ |
++ |
|
6 |
+ |
+++ |
+++ |
++ |
|
8 |
+ |
+++ |
++ |
+++ |
* + Слабое; ++ умеренное; +++ сильное.
Среди изменений отмечались: потеря равновесия, изменение цвета кожи, увеличение движений жаберных крышек, выделение слизи, подергивание, неустойчивое движение и заглатывание воздуха.
При этом тяжесть нарушений клинических и поведенческих признаков увеличивалась с повышением концентрации и наиболее ярко проявлялась при концентрациях 6 и 8 мг/л.
Бисфенол А при остром действии оказывал значимое воздействие на локомоторную активность данио. В контроле рыба демонстрировала типичное поведение для теста открытого пространства (табл. 2, рис. 1, а): большую часть времени она проводила во внешнем кольце (157,7 с) с меньшей скоростью движения (6,3 см/с), при этом проявляя исследовательскую активность и выплывая во внутренний круг.
Таблица 2
Table 2
Показатели локомоторной активности Danio rerio,
подвергавшихся острому воздействию бисфенола А
Indicators of locomotor activity of Danio rerio exposed to acute exposure to bisphenol A
|
Концентрация, мг/л |
Зона |
Время в зоне, с |
Время бездействия, с |
Дистанция, см |
Скорость, см/с |
|
Контроль |
Внутренний круг |
137,7 ± 19,9 |
32,7 ± 6,5 |
875,9 ± 162,1 |
8,2 ± 0,6 |
|
0,5 |
131,3 ± 12,7 |
30,4 ± 7 |
749,1 ± 152,3 |
8,6 ± 1,1 |
|
|
1 |
121,1 ± 28,9 |
23,2 ± 6,7 |
1 396,9 ± 117,7* |
10 ± 0,8 |
|
|
2 |
122,9 ± 24,7 |
28,3 ± 5,1 |
1 470,8 ± 123,7 |
9,6 ± 1,1 |
|
|
4 |
113,6 ± 25,1 |
15,7 ± 4,4 |
1 397,5 ± 349,3 |
11 ± 1,3 |
|
|
6 |
135,7 ± 22,4 |
10,4 ± 2,1 |
1 628,2 ± 269,2 |
11 ± 1,6 |
|
|
8 |
140,2 ± 33,6 |
3,2 ± 1,4 |
1 602,7 ± 365,6 |
12 ± 1,1 |
|
|
Контроль |
Внешнее кольцо |
157,7 ± 21,2 |
42,2 ± 5,8 |
1 034,6 ± 130,5 |
6,3 ± 1,2 |
|
0,5 |
165,8 ± 13,2 |
43,4 ± 7,2 |
1 209 ± 187,7 |
7,3 ± 1,7 |
|
|
1 |
171,5 ± 31,3 |
39,3 ± 12,6 |
2 135 ± 323,2 |
8,5 ± 1,8 |
|
|
2 |
175,1 ± 24,8 |
21,5 ± 6,8 |
1 883,7 ± 442,5 |
9,3 ± 1,4 |
|
|
4 |
182,8 ± 26,4 |
21,6 ± 7,7 |
1 551,6 ± 326,8 |
10 ± 1,9 |
|
|
6 |
162,5 ± 20,3 |
16,8 ± 5,7 |
1 694,1 ± 479,3 |
10,7 ± 1,3 |
|
|
8 |
144,6 ± 32,4 |
6,7 ± 1,4 |
1 399,5 ± 372,3 |
10,4 ± 0,4 |
|
|
Контроль |
Вся емкость |
300 |
75 ± 9,9 |
1 910,5 ± 169,3 |
7 ± 0,8 |
|
0,5 |
73,8 ± 12,5 |
1 958,1 ± 235,5 |
7.4 ± 0,9 |
||
|
1 |
62,5 ± 11,3 |
3 531,9 ± 233,2 |
9,1 ± 0,9 |
||
|
2 |
49,8 ± 9,8 |
3 354,5 ± 455,3 |
9,3 ± 1 |
||
|
4 |
37,3 ± 8,4 |
2 949,1 ± 614,2 |
10,2 ± 1,1 |
||
|
6 |
27,3 ± 4,6 |
3 322,3 ± 397,8 |
10,9 ± 1,1 |
||
|
8 |
9,9 ± 2,4 |
3 002,2 ± 267,3 |
11,1 ± 0,8 |
* Значения, выделенные жирным шрифтом, достоверно отличались от контроля.
Поведение контрольных рыб во внутреннем круге характеризовалось меньшей пройденной дистанцией (875,9 см) и большей скоростью движения (8,2 см/с).
В свою очередь, рыбы, экипируемые в растворе БФА в концентрации 0,5 мг/л, проявляли схожую локомоторную активность (см. рис. 1, б), демонстрируя незначительное увеличение пройденной дистанции и скорости движения в сравнении с контролем.
Начиная с концентрации 1 мг/л данио проявляют большую локомоторную активность, что выражается в достоверном (p < 0,05) увеличении пройденного расстояния (как во внешнем кольце, так и во внутреннем круге), а также средней скорости движения (см. рис. 1, в, г). Например, в группе, подвергшейся действию БФА в концентрации 2 мг/л, скорость движения во внутреннем круге составила 9,6 см/с, а во внешнем кольце 9,3 см/с, достоверно отличаясь от показателей контроля (p < 0,05). В более высоких концентрациях тенденция сохраняется, достигая максимальных значений при 6 и 9 мг/л, где средняя скорость рыб во всей емкости составила 10,9 и 11,1 см/с соответственно.
Обратная зависимость была выявлена для показателя времени бездействия. По ходу увеличения концентрации БФА наблюдалось выраженное снижение данного параметра, который во всей емкости для контроля составил 75 с, а в концентрации 8 мг/л значимо снизился до 9,9 с (p < 0,05).
Рис. 1. Локомоторные траектории активности Danio rerio,
подвергавшихся острому воздействию различных концентраций бисфенола А:
а – контроль; б – 0,5 мг/л; в – 1 мг/л; г – 2 мг/л; д – 4 мг/л; е – 6 мг/л; ж – 8 мг/л
Fig. 1. Locomotor trajectories of Danio rerio
activity exposed to acute exposure to various concentrations of bisphenol A:
a – control; б – 0.5 mg/l; в – 1 mg/l; г – 2 mg/l; д – 4 mg/l; e – 6 mg/l; ж – 8 mg/l
Отмеченные изменения показателей локомоторной активности наглядно представлены на рис. 1. В концентрациях 0,5 и 1 мг/л заметно проявление поведенческого паттерна предпочтение места, схо-
жее с контрольными особями и выраженное в большем времени нахождения в одном из квадрантов круга (см. рис. 1, б, в). Начиная с концентрации 2 мг/л рыбы проявляют меньший тигмотаксис
и проводят равное время во внешнем кольце и внутреннем круге, проплывая сравнимое расстояние (см. рис. 1, г, д). Уже в концентрациях 6 и 8 мг/л рыбы проходят расстояние во внутреннем круге, в два раза превосходящее показатель контроля (см. табл. 1, рис. 1, е, ж).
Для выявления возможной зависимости между концентрацией БФА и показателями локомоторной активности данио был проведен линейно-регрессионный анализ. Значимая отрицательная корреляция наблюдалась между концентрацией БФА и временем бездействия (рис. 2, а, б).
Так, коэффициент корреляции (R2) во внутреннем круге составил 0,6765, а во внешнем кольце 0,7140. При этом значимых зависимостей между концентрацией поллютанта и временем нахождения в определенной зоне тестовой емкости выявлено не было. Следует отметить наличие положительной связи между дистанцией, пройденной рыбой во внутреннем круге, и концентрацией БФА (R2 = 0,4479; см. рис. 2, в). Столь низкий коэффициент корреляции связан с тем, что значительного изменения пройденной дистанции не наблюдалось, начиная с концентрации 1 мг/л.
Схожая положительная зависимость была выявлена для показателя средней скорости движения, которая постепенно увеличивалась по мере роста концентрации БФА как во внутреннем круге
(R2 = 0,4365; см. рис. 2, г), так и во внешнем кольце (R2 = 0,4011; см. рис. 2, д). Для других измеренных показателей локомоторной активности значимых зависимостей установлено не было.
Рис. 2. Линейно-регрессионный анализ показателей локомоторной активности Danio rerio,
подвергавшихся острому воздействию бисфенола А: а – время бездействия, внутренний круг; б – время бездействия, внешнее кольцо; в – дистанция, внутренний круг; г – скорость, внутренний круг; д – скорость, внешнее кольцо
Fig. 2. Linear regression analysis of Danio rerio locomotor activity indicators
exposed to acute exposure to bisphenol A: a – inactivity time, inner circle; б – inactivity time, outer ring;
в – distance, inner circle; г – speed, inner circle; д – speed, outer ring
Обсуждение
Представленные данные оценки поведения данио в аквариумах экспозиции сходятся с ранее полученными результатами других авторов. Например,
в работе [6] короткая экспозиция Oncorhynchus mykiss и Vimba vimba также приводила к потере баланса и изменению скорости плавания. При этом длительная экспозиция БФА в более низких концентрациях приводила к такому же изменению локомоторной активности у Aristichthys nobilis: изменение положения тела, аномальное плавание и анорексия [8]. Таким образом, действие БФА на поведение рыбы уже ярко проявляется при визуальной оценке и говорит о существенном влиянии данного соединения на когнитивные функции организма.
Локомоторная активность и поведение, наблюдаемые у контрольных особей данио в данном эксперименте, являются классическим проявлением противоречия между необходимостью избегать открытых пространств и тягой к исследовательской активности, что было описано в множестве работ [14, 15, 21, 24]. В таком случае действие БФА выражалось в нарушении данного паттерна. Например, увеличение средней скорости движения в высоких концентрациях БФА связано с появлением в движении у данио однократных, но повторяющихся ускорений (рывков) в одном направлении. Помимо этого, в данных концентрациях у рыб наблюдалась неустойчивость в движении, которая выражалась в резком изменении направления [24]. В ряде случаев она сочеталась с резким ускорением. Следует, однако, отметить, что наиболее значительный рост скорости движения и пройденного расстояния был выявлен начиная с концентрации 1 мг/л. Описанное действие низкой концентрации (500 мкг/л) БФА на данио выражалось в уменьшении локомоторной активности, снижении агрессии и социальной активности, а также нарушении циркадных ритмов [16]. Очевидно, что действие низких и высоких концентраций БФА на поведенческую активность рыб значительно различается, при этом сохраняя свою выраженность.
Увеличение двигательной активности напрямую связано со снижением времени бездействия. Зафиксированный в опыте концентрация-зависимый эффект указывает на проявление у рыб гиперактивности, которая характеризуется аномально быстрым плаванием на протяжении длительного времени. При этом типичные для данио и наблюдаемые в контроле колебания локомоторной активности, представленные чередованием фаз быстрой и низкой скорости [24], в высоких концентрациях БФА практически не наблюдались. В работе [17] было продемонстрировано, что краткосрочная экспозиция личинок данио приводит к увеличению локомоторной активности и нарушает предпочтение к свету/темноте. Паттерны поведения, зафиксированные в данном исследовании, характерны для тревожноподобного поведения, которое наблюдается либо при потенциальной опасности, либо может быть вызвано различными стимулами/веществами [20].
Нарушение поведения, вызванное БФА, приведенное в данной работе и описанное другими авторами, может быть связано с действием поллютанта на нейрохимические процессы. В частности, было показано, что эстрогенная активность веществ может оказывать влияние на дофаминергическую, серотонинергическую и холинергическую системы [25]. Данные, приведенные в работе [17], показывают, что БФА приводит к достоверному снижению активности серотониновых рецепторов, ацетилхолина, холина, бетаина, фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты. Вышеприведенные данные указывают на существование связи между метаболизмом нейрохимических соединений и изменением поведения при действии БФА [4]. В частности, можно предположить, что снижение уровней ацетилхолина и дофамина ассоциировано с изменением локомоторной активности и проявлением тревожноподобного поведения у данио [26].
Важно отметить, что представленные результаты и имеющиеся на данный момент сведения о токсичности БФА не позволяют провести однозначную связь между эстрогенной активностью поллютанта и нарушением поведенческих паттернов рыбы. По всей видимости, помимо гормональной регуляции поведения может также проявляться токсическое действие изучаемых концентраций БФА через другие регуляторные механизмы. Представленные в работе методы оценки локомоторной активности лабораторного вида рыб возможно использовать не только в токсикологии, но и при оценке различных биологически активных компонентов и безопасности кормов, которые могут оказывать влияние на кормовое поведение [27].
Заключение
Краткосрочная экспозиция данио в спектре концентраций бисфенола А приводила к проявлению следующих поведенческих и клинических признаков: потеря равновесия, изменение цвета кожи, увеличение движений жаберных крышек, выделение слизи, подергивание, неустойчивое движение и заглатывание воздуха.
Тест открытого пространства позволил установить, что бисфенол А приводит к значительному увеличению локомоторной активности данио, которая выражалась в значимом увеличении средней скорости движения (до 11,1 см/с) и снижении времени бездействия (до 9,9 с).
Показатели локомоторной активности данио, достоверно изменяющиеся при действии бисфенола А, демонстрировали явную зависимость концентрация-эффект: для времени бездействия во внутреннем круге R2 = 0,6765 и во внешнем кольце R2 = 0,7140; для скорости движения во внутреннем круге R2 = 0,4365 и во внешнем кольце R2 = 0,4011.
Паттерны поведения, зафиксированные в данном исследовании, а именно гиперактивность, повышенная исследовательская активность и снижение тигмотаксиса, характерны для тревожноподобного поведения.
