Введение
Боковой амиотрофический склероз (далее – БАС) – нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы, которое характеризуется прогрессирующей дегенерацией двигательных нейронов в головном и спинном мозге, мышечной слабостью, а также непосредственным старением организма (проявляется примерно в возрасте 60 лет) [1–4]. В конечном итоге прогрессирующая дегенерация приводит к дыхательной недостаточности – основной причине смерти при БАС [1, 5, 6]. Большинство случаев БАС являются спорадическими, но примерно 10 % случаев обусловлены наследственными мутациями в идентифицированных генах [7]. Мутации, вызывающие БАС, были обнаружены более чем в 40 генах, среди них наиболее частыми являются гены SOD1, C9orf72, FUS и TDP-43 (известный как TARBP, или ДНК-связывающий белок TAR) [7–9].
Cu-, Zn-зависимая супероксиддисмутаза 1 (SOD1) является первым белком, для которого обнаружена связь с БАС [10]. Функция SOD1 заключается в катализе преобразования высокоактивного супероксидного радикала (O2-), вырабатываемого в процессе клеточного дыхания, в молекулярный кислород (O2) и перекись водорода (H2O2) [7, 11]. Многочисленные исследования демонстрируют повышенный уровень окислительного стресса при БАС [12–14]. Установлено, что около 20 % случаев семейного БАС (что составляет 5–10 % всех случаев) вызваны мутациями в гене SOD1 [15]. Именно поэтому окислительный стресс можно рассматривать в качестве одного из центральных механизмов в патогенезе БАС [16].
На сегодняшний день у человека описано около 200 мутаций hSOD1, связанных с БАС [17]. Большинство из них являются миссенс-мутациями [18]. Один из наиболее известных патологических механизмов БАС, связанного с SOD1, – это наличие окислительного стресса выше порогового значения, вызванного высоким уровнем недеактивированных свободных радикалов и образованием реактивных форм кислорода/азота [4, 16]. Таким образом, животные и клеточные культуры с мутациями в гене SOD1 могут быть использованы в качестве моделей БАС для изу-
чения его механизмов [16]. В настоящее время известны линии Drosophila melanogaster с мутациями в гене SOD1, включая семейную (SODF) и спорадическую (SODS) формы [5, 19]. В ряде исследований показано, что нулевые мутации гена SOD1 у Drosophila melanogaster, такие как делеции или миссенс-мутации, инактивирующие ферментативную активность белка, приводили к развитию характерного фенотипа. При этом у дрозофил была резко (на 85–90 %) сокращена медианная продолжительность жизни, нарушена локомоторная активность и снижена устойчивость к условиям окислительного стресса [18–20].
Плодовая мушка Drosophila melanogaster является распространенным генетическим модельным объектом, для которого описаны гены, ассоциированные с болезнями на тканеспецифическом и клеточно-специфическом уровнях. Эти гены можно активировать или подавлять для выявления патологических поведенческих реакций организма [7]. Кроме того, дрозофила простой в обращении и содержании объект экспериментальной генетики [7]. В настоящее время Drosophila активно используется при изучении таких нейродегенеративных заболеваний, как болезни Хантингтона [21], Паркинсона [22], Альцгеймера [23] и боковой амиотрофический склероз [5, 7, 24]. В качестве модели различных заболеваний Drosophila является эффективной для выявления возможных генетических механизмов и моделирования фенотипов заболеваний. Кроме того, дрозофилу используют для тестирования потенциальных терапевтических средств [25].
Модель БАС Drosophila с мутацией в гене sod1 характеризуется высоким фенотипическим сходством с пациентами с БАС на разных уровнях функциональной организации, включая двигательные нарушения, дегенерацию моторных нейронов, наличие внутриклеточных включений, митохондриальных нарушений, окислительных повреждений и сниженной выживаемости (ранняя летальность) [4, 5, 26, 27]. Данные особенности позволяют использовать дрозофилу при проведении скрининга предполагаемых нейропротекторных агентов, а также для анализа генетических механизмов и фенотипических признаков БАС [4].
На сегодняшний день БАС является неизлечимым заболеванием, причины которого в большинстве случаев неизвестны, а механизмы повреждения двигательных нейронов сложны и полностью не изучены. В связи с этим ведется активный поиск терапевтических вмешательств, направленных на облегчение симптомов, предотвращения осложнений и замедления прогрессирования заболеваний [4, 8, 16]. Особый интерес представляет разработка новых препаратов на основе природных соединений с антиоксидантной активностью, которые при низком риске возникновения побочных эффектов позволят отсрочить данное заболевание и улучшить качество жизни с возрастом [28].
Черноплодная рябина богата фенольными соединениями, включая процианидины, антоцианы, фенольные кислоты и их аналоги [29–32], являющиеся природными антиоксидантами и противовоспалительными фитохимическими веществами и способны снижать уровень свободных радикалов в организме и за счет этого увеличивать выживаемость в условиях окислительного стресса [33, 34]. Ягоды близкой к черноплодной рябине аронии (×Sorbaronia mitschurinii) также оказывают положительный эффект на продолжительность жизни (далее – ПЖ) плодовых мушек, обладают антипролиферативным, антиоксидантным, противовоспалительным, антимикробным, гастропротекторным эффектом, а также улучшают когнитивное состояние модельных организмов при нейродегенеративных заболеваниях (болезни Альцгеймера и Паркинсона) [35, 36]. Комбинация фитохимических веществ, содержащихся в ягодах черноплодной рябины или аронии, может обеспечить большую пользу для здоровья, чем отдельно используемые антиоксидантные соединения, за счет аддитивного и синергического эффектов [37]. Исходя из этого, мы предположили, что экстракт черноплодной рябины (×Sorbaronia mitschurinii) может оказать положительный эффект на выживаемость дрозофил с моделью БАС.
Материалы и методы
Экстракция. Ягоды черноплодной рябины (×Sorbaronia mitschurinii) были собраны в Ботаническом саду (Научная коллекция живых растений, № 507428) Института биологии Коми НЦ УрО РАН (Северо-Запад России) в осенний период (август–сентябрь). Экстракцию ягод проводили по методике, описанной ранее в работе [29]. Экспериментальные концентрации экстракта ягод черноплодной рябины были приготовлены из полученного этанольного экстракта путем разбавления 96%-ным этанолом.
Линии Drosophila. Для проведения экспериментов использовали линию с мутацией в гене супероксиддисмута-
зы 1 Sod1 n1 (#24492, Bloomington Stock Center, USA), основного цитоплазматического фермента, ответственного за обезвреживание свободных радикалов. Линия Sod1n1 характеризуется средней продолжительностью жизни гомозигот –
около 11 суток [20].
Анализ продолжительности жизни. Контрольные и экспериментальные особи были собраны в течение 24 ч после вылупления имаго. С использованием углекислотного наркоза (Genesee Scientific, США) мух сортировали по полу и рассаживали в пробирки по 30 особей. Самцы и самки жили раздельно. Начиная с первого дня жизни имаго ежедневно вели подсчет числа умерших особей, два раза в неделю мух переносили на свежую среду. Контрольных
и опытных мух содержали при температуре +25 °С и 12-часовом режиме освещения. Для поддержания стабильных условий содержания использовали климатические камеры Binder KBF720-ICH (Binder, Германия). Состав питательной среды, на которой содержали контрольных и опытных животных при проведении всех экспериментов, был следующий: вода – 1 л, кукурузная мука – 92 г, сухие дрожжи – 32,1 г, агар-агар – 5,2 г, глюкоза – 136,9 г, раствор 10%-ного нипагина в этаноле – 10 мл, раствор 50%-ной пропионовой кислоты – 10 мл [29].
Экстракт ягод черноплодной рябины в 96%-ном этаноле (30 мкл) наносили на поверхность питательной среды. В качестве контроля использовали среду с добавлением этилового спирта в том же объеме. Изучали экстракт в концентрациях 0,1; 1; 5 и 10 мг/мл. Дрозофил кормили экстрактом на протяжении всей жизни.
Статистический анализ полученных результатов. Значимость различий между кривыми выживаемости оценивали с помощью логрангового теста [38]. Анализ статистических данных выполняли с помощью онлайн приложения для анализа выживаемости OASIS 2 [39].
Результаты и их обсуждение
Старение – неизбежный процесс, который вызывает существенные изменения в экспрессии генов в органах и тканях, включая центральную нервную систему [40–42]. Ряд характерных признаков старения, включая геномную нестабильность, эпигенетические изменения и клеточное старение, связаны с нейродегенерацией, что позволяет рассматривать старение в качестве основного фактора риска развития нейродегенеративных заболеваний, включая БАС [43]. Поскольку риск развития БАС резко возрастает с возрастом, всемирная тенденция к увеличению продолжительности жизни, вероятно, будет способствовать глобальному росту заболеваемости БАС [44].
В настоящей работе в качестве дрозофилиной модели БАС использовали линию с мутацией в гене Sod1 n1, основного цитоплазматического фермента, ответственного за обезвреживание свободных радикалов. В ходе проведенных экспериментов установили, что экстракт ягод черноплодной рябины оказал влияние на статистически значимые изменения показателей ПЖ самцов, но не на ПЖ самок. Так, отмечено снижение ПЖ с увеличением концентрации экстракта. Добавление на среду экстракта в концентрации 0,1 мг/мл приводило к увеличению медианной ПЖ самцов на 22 % (p<0,0001), в то время как добавление экстракта в концентрации 1 мг мл привело к снижению максимальной ПЖ на 14 % (p<0,05), а добавление в пищу экстракта в концентрации 5 мг/мл – к снижению медианной ПЖ на 33 % (p<0,01) (рисунок, таблица).
С помощью ранее проведенного нами анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии установлено, что главные составляющие экстракта черноплодной рябины (×Sorbaronia mitschurinii) – антоцианы дельфинидин и цианидин [29]. Ранее нами было показано, что этанольный экстракт плодов черноплодной рябины в концентрации 10 мг/мл увеличивает медианную ПЖ дрозофил на 2 % у самцов и на 10 % у самок линии elav[c155]-Gal4>UAS-Aβ42, которая является моделью болезни Альц-
геймера у дрозофилы [36]. В некоторых исследованиях антоцианы также показали эффективность при лечении БАС. Известно, что экстракт аронии (Aronia melanocarpa) в концентрации 2,5 мг/мл увеличивает максимальную ПЖ D. melanogaster на 9 %, что, вероятно, было обусловлено повышением уровня антиоксидантных ферментов (SOD, CAT и GPx) и экспрессией генов устойчивости к стрессу (Hsp68, l(2)efl и Jafrac1) [33]. Обогащенный антоцианами экстракт из клубники и его основной антоциановый компонент, каллистефин, значительно задерживают начало заболевания и увеличивают выживаемость в модели БАС у мышей с мутантным геном SOD1G93A при добавлении в пищу до развития симптомов [45]. Также показано, что антоцианы напрямую модулируют пути сигнализации, способствующие выживанию и апоптозу, что еще больше усиливает их нейропротекторные эффекты. Плейотропная природа этих соединений делает их весьма привлекательными в качестве потенциальных терапевтических средств для лечения таких заболеваний, как БАС, которые обладают сложной этиологией и прогрессированием, характеризующимися как окислительным стрессом, так и воспалением [45].
Исследования на дрозофилах позволили в контексте БАС с эктопической экспрессией hSOD1 легко тестировать различные соединения на предмет их защитного или негативного действия на продолжительность жизни или двигательную активность. Так, α-липоевая кислота (LA), полученная из растений и известная своими различными свойствами, включая антиоксидантный потенциал [46], была протестирована на дрозофилах, экспрессирующих hSOD1G85R в мотонейронах. Было показано, что LA смягчает нейротоксичность, увеличивая продолжительность жизни и улучшая двигательную активность у мух hSOD1G85R [47]. Таким же методом также тестировался γ-оризанол (Orz), компонент масла рисовых отрубей, известный своей антиоксидантной активностью [48]. В контексте БАС на дрозофилах Orz увеличивал экспрессию HSP70 и смягчал окислительное повреждение [49]. Эти результаты открывают возможности для других исследований по изучению роли новых препаратов, потенциально нейропротекторных при БАС [7].
Заключение
В проведенном нами исследовании выявлено, что этанольный экстракт плодов черноплодной рябины (×Sorbaronia mitschurinii) в наименьшей концентрации (0,1 мг/мл) достоверно увеличил медианную продолжительность жизни самцов на 22 %, при этом с увеличением концентраций (1 и 5 мг/мл) снижал как медианную, так и максимальную продолжительность жизни самцов с моделью болезни амиотрофического склероза. Вне зависимости от концентраций (0,1; 1; 5 и 10 мг/мл) экстракт черноплодной рябины не оказывал статистически значимого воздействия на показатели продолжительности жизни самок с моделью болезни амиотрофического склероза.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
