Введение. Микотоксины, как правило, обнаруживаются в продуктах питания, кормах, молочных продуктах и напитках, что впоследствии приводит к серьезным проблемам со здоровьем у людей и животных. Неудивительно, что загрязнение микотоксинами вызывает озабоченность во всем мире [1–4]. В связи с этим поиск эффективных средств профилактики микотоксикозов является актуальным.
Среди всех микотоксинов афлатоксины, зеараленон и Т-2 токсин привлекают особое внимание из-за вызываемых ими тяжелых последствий для здоровья людей и животных. Воздействие микотоксинов приводит к большим экономическим потерям из-за снижения производительности, ухудшения конверсии корма, плодовитости и повышения восприимчивости к экологическим стрессам и инфекционным заболеваниям [5–6].
Т-2 токсин является одним из наиболее токсичных трихотеценовых микотоксинов типа А, наносящих серьезный вред клеткам иммунной системы, печени, почек и головного мозга. Он часто встречается в зерновых продуктах и кормах для животных [7–8].
Существует много афлатоксинов, но афлатоксин В1 является наиболее токсичным. Это сильный канцероген (группа 1). Из-за своей распространенности и сильной токсичности афлатоксин В1 часто рассматривается в качестве основного объекта исследования микотоксинов [9].
Зеараленон приводит к нарушению синтеза эстрогена и гормонов гипофиза и функции половых желез. Его структура аналогична структуре 17β-эстрадиола, что позволяет ему конкурентно связываться с рецепторами эстрогена. Репродуктивная токсичность зеараленона выражается в снижении овуляции, увеличении числа мертворождений, дистоций и т.д. [10].
Систематические экспериментальные исследования ультраструктурных и морфологических изменений, вызванных совместным присутствием в корме афлатоксина В1, Т-2 токсина и зеараленона в высоких дозах, отсутствуют, что обусловливает необходимость настоящего исследования.
Первым органом, в котором проявляются патологические морфологические изменения при микотоксикозах, является печень, что предопределило выбор именно этого органа в качестве объекта исследования. При этом митохондрии представляют собой органеллы, которые подвергаются самым критичным изменениям [11].
Важным вопросом в отношении микотоксинов является детальная характеристика их молекулярного механизма действия, что необходимо для создания эффективной стратегии профилактики и лечения микотоксикозов.
Цель исследования – изучение влияния разработанных нами профилактических комплексов, обладающих сорбционными, антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами, на ультраструктуру печени и морфометрические характеристики митохондрий крыс при одновременном попадании в организм сразу нескольких микотоксинов.
Материалы и методы. Работа выполнена на 80 белых крысах массой 150–170 г, распределенных на 8 групп по 10 крыс в каждой. Микотоксины добавляли в основной рацион путем ступенчатого перемешивания (афлатоксин В1 – 2,5 мг/кг, Т-2 токсин – 5 мг/кг и зеараленон – 2,0 мг/кг корма) в течение трех недель. Дозы были выбраны исходя из принципа «наихудшего сценария» возможной контаминации микотоксинами в производственных условиях. Биологическим контролем служила первая группа крыс, токсическим контролем – вторая группа. Крысы 3–5-х групп дополнительно к токсичному рациону получали профилактические комплексы № 1, 2, 3 в дозе 0,25 % от рациона (№ 1 – β-глюканы, шрот расторопши, витамин Е, аскорбиновая кислота, левамизол; № 2 – бентонит, янтарная кислота, метилурацил; витамин А, пробиотический препарат «Флорин»; № 3 – галлуазит, метионин, β-глюканы, шрот расторопши). Крысы 6–8-х групп дополнительно к основному рациону получали соответственно профилактический комплекс № 1, 2 и 3 в дозировке, аналогичной таковой для 3–5-х групп.
Субмикроскопические исследования осуществлялись посредством метода ультратонких срезов [12]. Последовательность основных этапов проводки материала представлена в таблице.
Этапы подготовки материала для электронно-микроскопических исследований
|
Этап |
Компонент |
|
1 |
2 |
|
Фиксация |
1 % раствор глутарового альдегида (Serva, ФРГ) на 0,1 М фосфатном буфере (рН = 7,4), при t = 4 °С, 12 ч |
|
Промывка буфером |
0,1 М фосфатный буфер (рН = 7,4), 2 раза по 10 мин |
|
Фиксация |
2 % тетраоксид осмия OSO4 (Московский химзавод) на 0,1 М фосфатном буфере (рН = 7,4), при комнатной температуре, 2 ч |
|
Промывка буфером |
0,1 М фосфатный буфер (рН = 7,4) 2 раза по 10 мин |
|
Дегидратация |
Этиловые спирты восходящей концентрации – 30 %; 50; 70; 80; 96 % – 2 раза по 5 мин; абсолютные спирты 100(I), 100(II), 100(III) – 2 раза по 10 мин каждый; ацетон – 2 раза по 10 мин |
|
Импрегнация |
Ацетон + эпоновые смолы, в течение 3 суток и 3 соотношений: (2:1); (1:1) (1:2) |
|
Заливка в капсулы |
Эпоновые смолы |
Окончание табл.
|
1 |
2 |
|
Полимеризация |
Отверждение в термостате при t = 30 °С, t = 45 °С и t = 60 °С по 24 ч при каждом из температурных режимов |
|
Полутонкая резка |
Микротом LKB-III 8800 (Швеция) |
|
Ультратонкая резка |
Микротом Reichert-Jung Ultracut-E 6524-01 (Австрия) |
|
Контрастирование сеточек |
Уранилацетат 2 ч при 45 °С, цитрат свинца 1,5 мин в присутствии щелочи |
|
Съемка на фотопленку |
Электронный микроскоп JEM 100 CX-II («Jeol», Japan); фототехническая пленка Agfa orthochromatic |
|
Оцифровка снимков |
Сканер Epson perfection 4990 foto с разрешением 600 dpi |
Морфометрическая обработка полученных снимков проводилась в программе с открытым исходным кодом FIJI/ImageJ [13]. В ходе эксперимента изучено влияние профилактических комплексов на ультраструктуру гепатоцитов с оценкой площади, периметра, калиперометрического диаметра (диаметра Фере) и сферичности (C = 4π(S/P2), где C – коэффициент сферичности; S – площадь; P – периметр) митохондрий.
Статистическая обработка выполнялась в программах MS Excel и Statistica 6.0 и включала вычисления среднего значения показателей (M) и его стандартного отклонения (Sd), а также последующего попарного сравнения групп тестом Манна – Уитни. Для нивелирования эффекта множественности сравнений использовали поправку Бонферрони.
Проводили две серии попарных сравнений: группу биологического контроля сравнивали с остальными группами опыта; группу токсического контроля – также со всеми (кроме группы биологического контроля, так как это было сделано в первой серии сравнений).
Таким образом, исходя из количества проведенных тестов, уровень значимости α = 0,05 для всех тестов был скорректирован нами до α ≈ 0,0096.
Результаты и их обсуждение. Результаты статистического анализа полученных данных представлены на рисунке 1.
Рис. 1. Морфометрические характеристики митохондрий гепатоцитов крыс:
вертикальная черта соответствует величине стандартного отклонения (±Sd); верхние индексы показывают статистически значимые отличия с учетом поправки на влияние множественного сравнения: a – отличие от группы биологического контроля; b – отличие от группы токсического контроля
Графические данные демонстрируют, что в сравнении с группой биологического контроля экспериментальная группа токсического контроля характеризуется снижением морфометрических характеристик митохондрий (рис. 1). Добавление в рацион опытных крыс профилактических комплексов (№ 1, № 2 и № 3) способствует восстановлению данных показателей во всех трех группах (значения существенно выше, чем во второй группе). Однако не все средства показали одинаково сильный эффект. Наиболее близкими к группе биологического контроля оказались показатели в группе, получавшей профилактический комплекс № 3 (статистические отличия в сравнении с группой биологического контроля не выявлялись ни по одному из морфометрических показателей). Обогащение рациона профилактическими комплексами № 1 и № 2 определенным образом отражалось на значениях их морфометрических показателей, они были близки между собой. Все морфометрические показатели (кроме коэффициента сферичности митохондрий, который не показал отличий от биологического контроля) в группах, получавших эти профилактические комплексы, значимо отличались как от группы биологического контроля, так и от группы, получавшей токсический рацион.
Следует особо отметить, что введение в рацион профилактических средств № 1–3 без добавления микотоксинов не приводит к каким-либо статистически подтверждаемым изменениям морфометрических характеристик ультраструктур по сравнению с контрольной группой.
Примечательна в том числе и ультраструктурная организация гепатоцитов крыс, находившихся в эксперименте (рис. 2).
Рис. 2. Участки гепатоцитов белых крыс:
А – группа биологического контроля; Б – группа токсического контроля; В–Д – опытные группы (токсический рацион+профилактический комплекс № 1–3); Е–З – опытные группы контроля
безвредности профилактических комплексов № 1–3; м – митохондрии; ЭПС – эндоплазматическая сеть; д – десмосомы; ядр – ядрышко; лк – липидные капли
Для группы биологического контроля (рис. 2, А) характерны ядра, имеющие типичную округлую форму, с хорошо просматривающимися ядерными порами, с равномерным по всему периметру перинуклеарным пространством и гетерохроматином, сосредоточенным на периферии ядра. Встречаются ядрышки. Митохондрии округлой и удлиненной формы имеют плотный матрикс, в ряде органелл видны ламеллярные кристы. По всей цитоплазме встречается гликоген, пероксисомы отсутствуют. Хорошо видна эндоплазматическая сеть. Близкая по ультраструктуре картина (рис. 2, Е–З) наблюдается в группах, получавших профилактические комплексы № 1–3 в качестве добавки к основному рациону (контроль безвредности).
Выраженные деструктивные процессы характерны для группы токсического контроля (рис. 2, Б). Контур большинства ядер гепатоцитов имеет неровные очертания с изломами и впадинами. В ядрах визуализируется дезинтеграция хроматина, гетерохроматин слабо выражен. Цитоплазма электронно-светлая, практически лишена включений, в частности гликогена, пероксисом нет. Митохондрии имеют признаки деструкции мембран с просветленным матриксом, иногда средней электронной плотности. Кристы фактически не визуализируются. Эндоплазматическая сеть встречается редко и фрагментами.
Ядра гепатоцитов всех трех групп, получавших профилактические комплексы (рис. 2, В–Д) в дополнение к токсическому рациону, характеризуются равномерным, без деформаций, перинуклеарным пространством. Однако в группе, получавшей первый профилактический комплекс, выявляются изменения формы ядра, также не видно ядерных пор. Во всех трех группах ядра гепатоцитов имеют гетерохроматин, но в группе, получавшей профилактический комплекс № 1, он визуализируется в виде небольших фрагментов. Отмечается полиморфность митохондрий, имеющих средне- и плотно-электронный матрикс. Для ряда митохондрий группы, получавшей профилактический комплекс № 3, характерна визуализация крист.
Цитоплазма имеет среднюю электронную плотность. В группах, получавших профилактические комплексы № 2 и № 3, наличествуют включения (гликогенные гранулы и капли липидов). Хорошо визуализируется эндоплазматическая сеть.
Выявленные нами на субмикроскопическом уровне процессы изменений в митохондриях при воздействии микотоксинов в целом согласуются с информацией доступных научных источников. Так, зеараленон стимулирует изменения ультраструктур в митохондриях, аппарате Гольджи и шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, тем самым влияя на процессы секреции и клеточного метаболизма. Авторами [14] доказано, что для эпителия проксимальных канальцев почек и гепатоцитов характерны наибольшие деструктивные проявления при воздействии микотоксинов.
Заключение. Наиболее близкие к биологическому контролю ультраструктурные характеристики гепатоцитов были свойственны животным, получавшим дополнительно к токсическому рациону третий профилактический комплекс, в состав которого входят нанотрубки галлуазита с подтвержденной in vitro высокой адсорбционной способностью к афлатоксину В1, Т-2 токсину, зеараленону и охратоксину А; β-глюканы, способные связывать широкий спектр микотоксинов; шрот расторопши, богатый витаминами, минералами и антиоксидантными соединениями, стабилизирующими клеточные и субклеточные мембраны, а также метионин, участвующий в детоксикации микотоксинов в печени за счет повышения активности метильных групп [15]. Использованные в опыте первый и второй профилактические комплексы также оказали защитное действие на ультраструктуру гепатоцитов и морфометрические показатели митохондрий крыс, но выраженное в меньшей степени. Таким образом, для дальнейших исследований защитного эффекта при сочетанном микотоксикозе из предложенных нами комбинаций отобран наиболее эффективный третий комплекс препаратов.
