сотрудник
Россия
сотрудник
Россия
сотрудник
Россия
сотрудник
Россия
сотрудник
Россия
сотрудник
Россия
сотрудник
Россия
сотрудник
Россия
сотрудник
сотрудник
Россия
ГРНТИ 34.01 Общие вопросы биологии
ГРНТИ 34.03 Теоретическая биология
ГРНТИ 34.49 Радиационная биология
Цель: оценить влияние 3H-тимидина на индукцию двунитевых разрывов (ДР) ДНК в культивируемых мезенхимальных стволовых клетках (МСК) человека. Материал и методы: Выделение и культивирование МСК костного мозга человека проводили по стандартной методике. К культуре клеток добавляли стерильный раствора 3H-тимидина с различной удельной радиоактивностью и инкубировали в условиях СО2-инкубатора в течение 24 ч. Удельная радиоактивность 3H-тимидина в среде инкубации составляла 50–1600 кБк/мл. Для количественной оценки ДР ДНК использовали иммуноцитохимический анализ фокусов гистона γH2AX. Дополнительно оценивали долю делящихся клеток с использованием иммуноцитохимического анализа маркера клеточной пролиферации – белка Ki67. Результаты: Показано, что 24 ч инкубация МСК человека в культуральной среде, приводит к дозозависимому увеличению количества фокусов γH2AX. Наблюдается линейное увеличение числа фокусов γH2AX в диапазоне удельных активностей 50–400 кБк/мл, после чего относительный количественный выход фокусов на единицу удельной радиоактивности начинает снижаться. В целом, зависимость доза–эффект аппроксимируется квадратичной функцией у = 3,13 + 50,80x – 12,38x2 (R2 = 0,99), где у – количество фокусов γH2AX в клеточном ядре, а х – удельная радиоактивность в единицах 1000 кБк/мл. Обнаружено, что 24 ч инкубация МСК человека в культуральной среде, содержащей 800 и 1600 кБк/мл 3Н‑тимидина, приводит к статистически значимому снижению пролиферативной активности клеток по сравнению с контролем ~ в 1,25 и 1,41 раза соответственно. Своеобразное биологическое ограничение накопления трития в клеточном ядре хорошо объясняет наблюдаемый в наших исследованиях нелинейный характер зависимости образования ДР ДНК от удельной радиоактивности 3Н-тимидина в культуральной среде. Заключение: Количественный анализ фокусов γH2AX показал себя как хорошо воспроизводимый и высокочувствительный метод оценки индукции ДР ДНК в живых клетках при воздействии 3Н-тимидина. Анализ фокусов γH2AX будет крайне востребован для уточнения количественного выхода ДР ДНК в живых клетках на дозу β-излучения трития. Для этого необходимо провести корректный расчет дозы, получаемой клетками с учетом микрораспределения 3Н-тимидина в клеточном объеме и его накопления в ДНК живых клеток.
3Н‑тимидин, двунитевые разрывы ДНК, фокусы γH2AX, мезенхимальные стволовые клетки
Тритий (3H), радиоактивный изотоп водорода, является одним из основных побочных продуктов ядерной промышленности, попадающих в окружающую среду [1, 2]. Тритий превращается в стабильный изотоп гелия путем β-распада, излучая низкоэнергетический электрон со средней энергией 5,7 кэВ и частицу антинейтрино. В среднем длина пробега β-частицы, испускаемой тритием, составляет всего 0,4–0,6 мкм, что меньше диаметра соматической клетки [3]. Таким образом, тритий представляет опасность для здоровья человека только при поступлении в организм. В качестве изотопа водорода тритий входит в состав молекул воды (оксид трития – НТО), неорганических и органических молекул (органически связанный тритий – OСT) [4].
1. Kotzer T., Trivedi A. Dosimetric implications of atmospheric dispersal of tritium near a heavy-water research reactor facility // Radiat. Prot. Dosim. 2001. Vol. 93. P. 61–66.
2. Okada S., Momoshima N. Overview of tritium. characteristics, sources, and problems // Health Phys. 1993. Vol. 65. P. 595–609.
3. Alloni D., Cutaia C., Mariotti L. et. al. Modeling dose deposition and DNA damage due to low-energy beta(-) emitters // Radiat. Res. 2014. Vol. 182. P. 322–330.
4. Melintescu A., Galeriu D. Uncertainty of current understanding regarding OBT formation in plants // J. Environ. Radioact. 2017. Vol. 167. P. 134–149.
5. Dingwall S., Mills C.E., Phan N.et al. Human health and the biological effects of tritium in drinking water. Prudent policy through science – addressing the ODWAC new recommendation // Dose Response. 2011. Vol. 9. P. 6–31.
6. Umata T. Estimation of biological effects of tritium // J. UOEH. 2017. Vol.39. P. 25–33.
7. Little M.P., Lambert B.E. Systematic review of experimental studies on the relative biological effectiveness of tritium // Radiat. Environ. Biophys. 2008. Vol. 47. P. 71–93.
8. Task Group on Radiation Quality Effects in Radiological Protection CoREICoRP. Relative biological effectiveness (RBE), quality factor (Q), and radiation weighting factor (w(R)). A report of the International Commission on Radiological Protection // Ann ICRP. 2003. Vol. 33. P. 1–117.
9. Harrison J. Doses and risks from tritiated water and environmental organically bound tritium // J. Radiol. Prot. 2009. Vol. 29. P. 335–349.
10. Balonov M.I., Muksinova K.N., Mushkacheva G.S. Tritium radiobiological effects in mammals. review of experiments of the last decade in Russia // Health Phys. 1993. Vol. 65. P. 713–726.
11. Балонов М.И., Чипига Л.А. Оценка дозы от поступления окиси трития в организм человека. Роль включения трития в органическое вещество тканей // Радиац. гигиена. 2016. Т. 9. №4. С. 16 – 25.
12. Кочетков О.А., Монастырская С.Г., Кабанов Д.И. Проблемы нормирования техногенного трития // Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т. 9. №4. С. 815–819.
13. Korzeneva I.B., Kostuyk S.V., Ershova L.S. et al. Human circulating plasma DNA significantly decreases while lymphocyte DNA damage increases under chronic occupational exposure to low-dose gamma-neutron and tritium β-radiation // Mutation Res./Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 2015. Vol. 779. P. 1–15.
14. Osipov A.N., Grekhova A., Pustovalova M. et al. Activation of homologous recombination DNA repair in human skin fibroblasts continuously exposed to X-ray radiation // Oncotarget. 2015. Vol. 6. P. 26876–26885.
15. Osipov A.N., Pustovalova M., Grekhova A. et al. Low doses of X-rays induce prolonged and ATM-independent persistence of gammaH2AX foci in human gingival mesenchymal stem cells // Oncotarget. 2015. Vol. 6. P. 27275–27287.
16. Kotenko K.V., Bushmanov A.Y., Ozerov I.V. et al. Changes in the number of double-strand DNA breaks in Chinese hamster V79 cells exposed to gamma-radiation with different dose rates // Int. J. Mol. Sci. 2013. Vol. 14. P. 13719–13726.
17. Halazonetis T.D., Gorgoulis V.G., Bartek J. An oncogene-induced DNA damage model for cancer development // Science. 2008. Vol. 319. P. 1352–1355.
18. Chen J. Estimated yield of double-strand breaks from internal exposure to tritium // Radiat. Environ. Biophys. 2012. Vol. 51. P. 295–302.
19. Moiseenko V.V, Waker A.J, Hamm R.N, Prestwich W.V. Calculation of radiation-induced DNA damage from photons and tritium beta-particles. Part II. Tritium RBE and damage complexity // Radiat. Environ. Biophys. 2001. Vol. 40. P. 33–38.
20. Vignard J., Mirey G., Salles B. Ionizing-radiation induced DNA double-strand breaks. A direct and indirect lighting up // Radiother. Oncol. 2013. Vol. 108. № 3. P. 362–369.
21. Sharma A, Singh K, Almasan A. Histone H2AX phosphorylation. a marker for DNA damage // Methods Mol. Biol. 2012. Vol. 920. P. 613–626.
22. Tsvetkova A., Ozerov I.V., Pustovalova M et al. γH2AX, 53BP1 and Rad51 protein foci changes in mesenchymal stem cells during prolonged X-ray irradiation // Oncotarget. 2017. Vol. 8. № 38. P. 64317–64329.
23. Грехова А.К., Еремин П.С., Осипов А.Н. и соавт. Замедленные процессы образования и деградации фокусов γН2AX в фибробластах кожи человека, облученных рентгеновским излучением в малых дозах // Радиац. биол. Радиоэкология. 2015. Т. 55. № 4. C. 395–401.
24. Pustovalova M., Grekhova A., Astrelina Т. et al. Accumulation of spontaneous γH2AX foci in long-term cultured mesenchymal stromal cells. // Aging (Albany NY). 2016. Vol. 8. № 12. P. 3498–3506.
25. Pustovalova M., Astrelina Т.A., Grekhova A. et al. Residual γH2AX foci induced by low dose x-ray radiation in bone marrow mesenchymal stem cells do not cause accelerated senescence in the progeny of irradiated cells. // Aging (Albany NY). 2017. Vol. 9. №11. P. 2397–2410.
26. Paull T.T., Rogakou E.P., Yamazaki V. et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage // Curr. Biol. 2000. Vol. 10. P. 886–895.
27. Lobrich M., Shibata A., Beucher A. et al. GammaH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair. strengths, limitations and optimization // Cell Cycle. 2010. Vol. 9. P. 662–669.
28. Gonen R.G.U.. Alfassi Z.B.. Priel E. Production of DNA double strand breaks in human cells due to acute exposure to tritiated water (HTO). Conference of the Nuclear Societies in Israel. Dead Sea (Israel). 11–13 Feb 2014. P. 69–73.
29. Saintigny Y., Roche S., Meynard D., Lopez B.S. Homologous recombination is involved in the repair response of mammalian cells to low doses of tritium // Radiat. Res. 2008. Vol. 170. P. 172–83.
30. Озеров И.В., Осипов А.Н. Кинетическая модель репарации двунитевых разрывов ДНК в первичных фибробластах человека при действии редкоионизирующего излучения с различной мощностью дозы // Компьютерные исследования и моделирование. 2015. Т.7. № 1. С. 159–176.
31. Озеров И.B., Еремин П.С., Осипов А.Н. и соавт. Особенности изменения числа фокусов белков γH2AX и Rad51 в фибробластах кожи человека, подвергавшихся пролонгированному воздействию низкоинтенсивного рентгеновского излучения // Саратовский научно-мед. журнал. 2014. Т. 10. № 4. С. 739–743.
32. Озеров И.B., Бушманов А.Ю., Анчишкина Н.А и соавт. Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК в клетках линии V79 при длительном воздействии низкоинтенсивного γ-излучения // Саратовский научно-мед. журнал. 2013. Т. 9. № 4. С. 787–791.
33. Duque A., Rakic P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate // J. Neurosci. 2011. Vol. 31. № 42. P. 15205–15217.
34. Hoy C.A, Lewis E.D, Schimke R.T. Perturbation of DNA replication and cell cycle progression by commonly used [3H]thymidine labeling protocols // Mol. Cell Biol. 1990 Apr. Vol. 10. № 4. P. 1584–1592.
35. Hu V.W., Black G.E., Torres-Duarte A., Abramson F.P. 3H-thymidine is a defective tool with which to measure rates of DNA synthesis // FASEB J. 2002, Vol. 16. № 11. P. 1456–1457.
36. Jurikova M.. Danihel L., Polak S.. Varga I. Ki67, pcna, and mcm proteins. Markers of proliferation in the diagnosis of breast cancer // Acta Histochemica 2016. Vol. 118. P. 544–552.
