Введение
В полости рта находятся разнообразные микробиомы, включая бактерии, грибы, простейшие, вирусы. В ней определяют несколько биотомов: слизистая оболочка рта, зубная бляшка, десневая жидкость (ДЖ), зона десневой борозды и др.
В возникновении и развитии хронического генерализованного пародонтита (ХГП) играют роль сочетанные воздействия общих и местных факторов, находящихся в сложной взаимосвязи. Значение местных факторов в развитии пародонтита очевидно и не вызывает сомнения. Одним из них является зубная бляшка. Продолжительность существования микроорганизмов зубной бляшки зависит от их способности противостоять защитным силам организма человека. Примечательно, что микроорганизмы, у которых особенно хорошо развиты механизмы защиты, обитают в десневой бороздке и пародонтальных карманах. С увеличением глубины бороздки изменяется и показатель окислительно-восстановительного потенциала, и состав микрофлоры. На начальных стадиях формирования зубной бляшки преобладают грамположительные факультативные кокки, затем увеличивается количество грамположительных палочек, а в последующем возрастает количество грамотрицательных анаэробных форм [1―5].
Грибы рода Candida, являясь представителями нормальной микрофлоры, могут вести себя как сапрофиты. Однако при некоторых факторах экзогенного или эндогенного характера проявляют свои патогенные свойства и становятся участниками микробных ассоциаций при многих инфекционных заболеваниях, в том числе при воспалительных заболеваниях пародонта [6―10]. В последние годы в литературе используется термин «кандида-ассоциированный пародонтит», который отличается от кандидоза слизистой оболочки полости рта избирательной инвазией грибов не только в десневой эпителий, но и область пародонтальной связки [11―18]. При сочетании пародонтопатогенной микрофлоры и дрожжеподобных грибов рода Candida происходит суммарное действие. Однако клиническая картина кандидоза стирается и выявляется отягощенное основное заболевание. В связи с этим диагноз «кандида-ассоциированнный пародонтит» врачами практического здравоохранения ставится не часто, что сказывается на результатах лечения [19―24].
Цель исследования ― изучить видовой состав микрофлоры содержимого пародонтальных карманов при обострении ХГП и определить частоту встречаемости кандида-ассоциированного пародонтита.
Материал и методы исследования
Микробиологическое исследование для выявления пародонтопатогенной бактериальной флоры проводили с применением техники анаэробного культивирования (анаэростат Himedia). В качестве питательных сред использовали 5 % кровяной гемин-агар и среду Сабуро. Забор материала осуществляли из пародонтального кармана с помощью стандартных сорбирующих бумажных файлов (№ 30), которые помещали в 1 мл среды Стюарта для транспортировки в лабораторию. Посев на 5 % кровяной гемин-агар выполняли секторальным методом. Учет результатов роста колоний проводили на бинокулярной лупе МЛ-2Б. Идентификацию выделенных культур осуществляли по комплексу морфологических, биохимических и культуральных признаков с применением тест-систем API 200An (Франция). Всего выделено и идентифицировано свыше 180 штаммов представителей микробной флоры полости рта.
В содержимом пародонтальных карманов у 189 больных ХГП в стадии обострения (в возрасте от 30 до 44 лет, разного пола) также выявляли дрожжеподобные грибы с их последующей видовой идентификацией и определяли степень количественной обсемененности. При этом применяли микроскопическое и культуральное (микологическое) исследование.
Количество обсемененности грибами определяли по следующей методике. В соответствии с существующими рекомендациями тампон после забора материала помещали в 1 мл среды AC (Oxoid) и до момента доставки материала в лабораторию держали в холодильнике при температуре 4-6 °С. Доставку осуществляли в пределах 10-12 часов. Доставленный материал гомогенизировали в течение 2 минут и проводили количественный секторальный посев на среды, предназначенные для культивирования грибов. Количественный посев осуществляли на агар Сабуро с 1 % дрожжевым гидролизатом и добавкой ампиокса 2,5 г/л для подавления сопутствующей бактериальной флоры (селективная среда). Дальнейшее культуральное исследование проводили в соответствии с общепринятыми правилами медицинской микологии [25]. Полученные результаты обсемененности выражали через десятичный логарифм колониеобразующих единиц (lg КОЕ) в 1 мл.
После идентификации полученных изолированных колоний и подсчета их количества на среде Сабуро получали чистые культуры дрожжеподобных грибов. Культивирование проводили в анаэробных условиях 24 часа при температуре 37 °С, а затем еще 24 часа при комнатной температуре (до 5 суток).
С помощью комплекса морфологических, биохимических и культуральных признаков устанавливали вид выделенных дрожжеподобных грибов. Для дифференциации с сахаромицетами (истинными дрожжами) определяли наличие спор при окраске карболовым фуксином Циля. Для оценки типа филаментации использовали рисовый агар и проводили учет типа филаментации (Candida, Mycocandida, Mycotorula и др.). При этом также определяли наличие хламидоспор у вида С.albicans.
Всего выделено, идентифицировано и проанализировано 125 штаммов дрожжеподобных грибов.
Для подтверждения диагноза при положительном результате культурального исследования проводили микроскопическое исследование мазков-отпечатков, а также геноидентификацию грибов в материале из пародонтального кармана с применением полимеразной цепной реакции.
Материалом для исследования служили биоптаты десны, полученные при открытом кюретаже пародонтальных карманов.
Цитоморфологическое исследование проводили при помощи светового микроскопа в жидкой иммерсионной системе с 630-кратным увеличением. Фиксация проводилась по Майн-Грюнвальду, окраска ― по Романовскому―Гимзе.
Геноиндетификацию грибов проводили методом амплификации и детекции ДНК Candida albicans.
Результаты исследования и их обсуждение
В содержимом пародонтальных карманов при применении тест-систем API 200An (Франция) выделено и идентифицировано свыше 180 штаммов представителей микробной флоры, а видовой состав представлен в основном 9 видами. Они распределились следующим образом: род Streptococcus (5 видов), Staphilococcus (2 вида), дрожжеподобные грибы и коринебактерии (табл.1).
Среди стрептококков были выявлены различия в количестве штаммов. Больше всего составили стрептококки видов S. mitis (31 штамм ― 17,22 %) и S. mutans (30 штаммов ― 16,67 %), далее S. agalactis (26 штаммов ― 14,44 %) и S. salivarius (23 штамма ― 12,78 %), меньше всего были представители S. sanguis (17 штаммов ― 9,44 %).
К роду Staphilococcus относился 21 (11,67 %) штамм. Идентификацию их видов не проводили, ограничивались лишь определением способности свертывать цитратную плазму кролика (коагулазположительный). Этой способностью обладали 11 (6,11 %) штаммов (коагулазположительные), не обладали (коагулазотрицательные) 10 (5,56 %) штаммов.
Таблица 1
Идентификация выделенных культур в содержимом пародонтальных карманов
Table 1. Identification of isolated cultures in the contents of periodontal pockets
|
Вид |
Кол-во штаммов, абс. |
Удельный вес, % |
|
Стрептококки: |
|
|
|
- S. mitis |
31 |
17,22 |
|
- S. mutans |
30 |
16,67 |
|
- S. agalactis |
26 |
14,44 |
|
- S. salivarius |
23 |
12,78 |
|
- S. sanguis |
17 |
9,44 |
|
Стафилококки: |
|
|
|
- коагулазположительные |
11 |
6,11 |
|
- коагулазотрицательные |
10 |
5,56 |
|
Дрожжеподобные грибы |
21 |
11,67 |
|
Коринебактерии |
11 |
6,11 |
|
Всего |
180 |
100 |
К дрожжеподобным грибам относился 21 (11,67 %) штамм, коринебактериям (грамположительные палочки) ― 11 (6,11 %) штаммов.
Нами также изучена частота встречаемости данных видов микробных культур в содержимом пародонтальных карманов больных ХГП в стадии обострения. Она определялась в процентах путем деления числа случаев обнаружения конкретного вида на общее количество наблюдений и умножения на 100.
Результаты исследования показали, что у большинства больных в содержимом пародонтальных карманов встречаются S. mitis (у 116 ― 61,3 %), S. mutans (у 118 ― 62,43 %), S. agalactis (у 96 ― 50,709 %), S. salivarius (у 90 ― 47,63 %). Из стрептококков реже всего встречается S. sanguis (у 65 ― 34,39 %).
Также часто встречаются и дрожжеподобные грибы (у 79 ― 41,79 %).
Стафилококки и коринебактерии встречаются значительно реже (табл. 2).
Вышеуказанные микроорганизмы выделялись в основном в ассоциации, состоящие из двух, трех и даже четырех видов. В большинстве случаев (более 70 %) наблюдались ассоциации дрожжеподобных грибов с S. mitis или S. mutans, а также одновременно и с S. mitis и S. mutans. реже в ассоциации с другими стрептококками и коринебактериями.
Таблица 2
Частота встречаемости микроорганизмов в содержимом пародонтальных карманов
Table 2. Frequency of occurrence of microorganisms in the contents of periodontal pockets
|
Вид |
Кол-во штаммов, абс. |
Частота встречаемости, % |
|
Стрептококки: |
|
|
|
- S. mitis |
31 |
61,3 |
|
- S. mutans |
30 |
62,48 |
|
- S. agalactis |
26 |
50,79. |
|
- S. salivarius |
23 |
47,63 |
|
- S. sanquis |
17 |
34,39 |
|
Стафилококки: |
|
|
|
- коагулазположительные |
11 |
22,22 |
|
- коагулазотрицательные |
10 |
23,75 |
|
Дрожжеподобные грибы |
21 |
41,79 |
|
Коринебактерии |
11 |
23,8 |
|
Всего штаммов |
180 |
|
|
Всего количество больных |
189 |
|
Задачами следующего этапа исследования явились:
1) подтверждение результатов культурального исследования, свидетельствующего о наличии дрожжеподобных грибов морфологическими, а также молекулярно-генетическими исследованиями с помощью ПЦР;
2) видовая идентификация грибов;
3) определение степени количественной обсемененности пародонтальных карманов грибами (lg КОЕ в 1 мл).
Как было указано выше, из 189 больных ХГП при культуральном исследовании у 79 (41,79 %) были выделены дрожжеподобные грибы. Результаты культуральных исследований совпадали с результатами морфологических в 95,2 % случаях. При этом выявляли клетки дрожжеподобных грибов типичной морфологии (овальные, круглые), в некоторых случаях с почкой (всегда одной), псевдомицелий. В норме грибы рода Candida определяли в виде единичных дрожжеподобных клеток.
В начальных стадиях заболевания обнаруживали во многих полях зрения почкующиеся клетки грибов в небольших количествах (15-20), по мере развития заболевания количество элементов гриба возрастало, кроме обильно почкующихся бластоспор определяли псевдомицелий. При тяжелых хронических формах видны псевдомицелий и почкующиеся дрожжевые клетки более 30-40 во всех полях зрения, пенетрирующие сквозь десневой эпителий в пародонтальную связку.
По результатам анализа молекулярно-генетических исследований, проведенных с помощью ПЦР, совпадение отмечалось в 92,8 % случаев.
При идентификации выделенных чистых культур грибов установлено, что у 63 больных из 79 выделялся вид Candida albicans (у 79,75 % больных), причем у 15 пациентов в ассоциации с другими видами: с C.Krusei ― у 10, C.guilliermondii ― у 2 и C.glabrata ― у 3 (табл. 3).
С. Krusei выявлен у 21 больного (26,58 % больных), в том числе у 10 в ассоциации с C.albicans.
Виды C. stellatoidea и C. tropicalis выявлены всего лишь у трех и двух больных соответственно.
Таким образом, у больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения С.albicans по частоте выделения находился на первом месте, на втором ― С.Krusei.
Степень количественной обсемененности материала дрожжеподобными грибами нами изучена с учетом степени тяжести ХГП. При обострении ХГП легкой степени тяжести у 4 (13,79 %) больных отмечалась низкая степень обсемененности, у 25 (86,21 %) ― средняя. При ХГП средней степени тяжести у большинства больных (у 24 ― 88,89 %) наблюдалась умеренная степень, лишь
Таблица 3
Видовой состав штаммов дрожжеподобных грибов рода Candida,
выявленных у больных пародонтитом
Table 3. Species composition of strains of yeast-like fungi of the genus Candida,
revealed in patients with periodontitis
|
Вид грибов |
Количество больных |
|
|
абс. |
% |
|
|
Candida albicans |
48 |
60,76 |
|
Candida albicans в ассоциации с - С.Krusei - C.guilliermondii - C.glabrata |
10 2 3 |
12,66 2,53 3,80 |
|
Candida Krusei |
11 |
13,92 |
|
Candida stellatoidea |
3 |
3,8 |
|
Candida tropicalis |
2 |
2,53 |
|
Всего больных |
79 |
|
у 3 (11,11 %) ― высокая степень обсемененности. А при ХГП тяжелой степени у 20 (86,96 %) больных определялась высокая степень обсемененности, у 3 (13,04 %) ― средняя (табл. 4).
Выводы
Таким образом, согласно результатам проведенных исследований, кандида-ассоциированный пародонтит встречается в 41,79 % случаях. Видовой состав грибов представлен в основном Candida albicans и Candida Krusei. Степень обсемененности пародонтальных карманов грибами рода Candida зависит от степени тяжести пародонтита. При ХГП легкой степени тяжести отмечается низкая и средняя обсемененность, при ХГП средней степени тяжести ― средняя и высокая, а при ХГП тяжелой степени ― высокая.
Таблица 4
Обсемененность содержимого пародонтальных карманов грибом рода Candida в зависимости от степени тяжести заболевания
Table 4. Seeding of the contents of periodontal pockets with the fungus of the genus Candida depending on the severity of the disease
|
Степень тяжести |
Количество больных (абс., %) с разной степенью обсемененности (КОЕ/мл) |
М±m КОЕ/мл |
||
|
низкая (< 3 КОЕ/ мл) |
средняя (>3, <6 КОЕ/ мл) |
высокая (>6 КОЕ/ мл) |
||
|
ХГП легкой степени n =29 |
4 (13,79 %) |
25 (86,21 %) |
- |
3,8±0,01 |
|
ХГП средней степени n =27 |
- |
24 (88,89 %) |
3 (11,11 %) |
5,9±0,03 |
|
ХГП тяжелой степени n =23 |
- |
3 (13,04 %) |
20 (86,96 %) |
8,01±0,01 |
