Цель исследования – установить характер нарушений нереспираторных функций легких и их влияние на систему гемостаза при хронической ингаляции промышленного сероводородсодержащего газа (ССГ). Исследовано состояние параметров системы гемостаза (число и функция тромбоцитов, общее время свертывания, уровень растворимых фибрин-мономерных компексов (РФМК) и D-димера, скорость XIIа-зависимого эуглобулинового лизиса, активность факторов Виллебранда и VIII, протеина С и ингибитора тканевого активатора плазминогена-1 (ИТАП-1), содержание антитромбина III и плазминогена) у 146 белых лабораторных крыс самцов с учетом артерио-венозной разницы. Забор крови осуществляли из брюшной аорты (pars abdominalis aortae) («после легких») и из задней полой вены (vena cava caudalis) («до легких», что исключает влияние печени). Крысы были разделены на 9 групп: четыре опытные, которые подвергались воздействию ССГ в течение одного месяца (20 особей), двух месяцев (20 особей), трех месяцев (19 особей) и четырех месяцев (19 особей). ССГ подавался в камеры в концентрации 70±2,34 мг/м3 статическим способом (однократно). Ингаляция крысами газа продолжалась 4 часа в день, 5 дней в неделю. Группы контроля составили крысы, помещаемые в камеры с обычным составом воздуха в аналогичном режиме на срок, соответствующий одному, двум, трем и четырем месяцам (по 12 особей). Референтные параметры системы гемостаза были определены перед началом эксперимента у группы крыс из 20 особей. Установлено, что артерио-венозная разница по показателям РФМК (р<0,05), содержанию антитромбина III (р<0,05), активности протеина С (р<0,01) более выражена в группах 1 месяца воздействия ССГ. Увеличение активности тромбоцитов (р<0,05), фактора Виллебранда (р<0,05) и ИТАП-1 (р<0,001), а также замедление фибринолиза (р<0,05) указывает на повреждение эндотелия легочных капилляров к 4 месяцу ингаляции ССГ и снижение способности легких регулировать гемостазиологический баланс.
нереспираторная функция легких, система гемостаза, тромбин, сероводород-содержащий газ.
Нереспираторная роль легких в последнее время привлекает пристальное внимание специалистов экспериментальной и практической медицины [1, 6, 8]. Эндотелиоциты капилляров легких регулируют уровень ряда веществ в сосудистом русле, влияющих на агрегатное состояние крови [3, 11, 14]. Первичные или вторичные заболевания бронхолегочной системы приводят к отклонению функциональных характеристик тромбоцитов в сторону повышения и усиления прокоагулянтной активности плазменных факторов свертывания, что провоцирует тромбообразование [6, 8, 9, 13].
Актуально изучение влияния экологических факторов на развитие у человека бронхолегочной патологии. Сегодня увеличивается значение воздушных поллютантов для ряда систем организма, т.к. респираторные пути – лишь первичное звено в последующем метаболизме газовых промышленных отходов на клеточном и молекулярном уровнях [5, 7, 10, 11]. Для Астраханского региона чрезвычайное значение имеет исследование последствий воздействия сероводородсодержащего газа (ССГ), добываемого в промышленных масштабах [7].
Организм человека имеет мощную защиту от воздействия токсикантов. Механизм детоксикации включает процессы биотрансформаций поллютантов, процессы конъюгации, антирадикальной и антиперекисной защиты [3]. Хотя эти механизмы имеют защитный характер, однако, в ряде случаев, могут играть и отрицательную роль. Это связано с тем, что происходящие запредельные изменения в окружающей среде зачастую превышают адаптационные возможности организма и, в конечном счете, приводят к их срыву [7, 8].
Изучение хронического влияния производственных факторов сероводородсодержащих компонентов на формирование экологически детерминированных заболеваний является одной из актуальных проблем [10, 12]. В течение последних десятилетий опубликовано множество экспериментальных и клинических работ, посвященных изучению негазообменной функции легких [6, 8, 9, 11].
Учитывая, что нереспираторные функции легких тесно связаны с основными газообменными функциями, становится понятным, что гипоксия, в свою очередь, может служить пусковым моментом активации тромбоцитов. Принимая во внимание, что ССГ при хроническом воздействии обладает тромбинной направленностью, а также формирует гипоксию смешанного характера, очевиднa актуальность нашего исследования в определении гемостазрегулирующей функции легких в условиях экологического неблагополучия.
Цель исследования – установить характер нарушений метаболических функций легких и их влияние на систему гемостаза при хронической ингаляции промышленного сероводородсодержащего газа.
Материалы и методы исследования
Исследование было выполнено на 146 белых лабораторных крысах, массой тела 240 (до эксперимента) – 265±15 г (к концу 4-го месяца затравки). Возраст животных соответствовал 10-14 месяцам жизни. Условия в виварии соответствовали Commission of the European Communities, 86/609/ЕЕС. Животные находились в условиях хронического воздействия ССГ в камерах с контролируемым составом воздушно-газовой смеси концентрацией по сероводороду 70±2,34 мг/м3 по 4 часа 5 дней в неделю. В зависимости от общего периода воздействия особи были поделены на опытные группы: №1, 2, 3 и 4, соответственно, пребывавшие в эксперименте 1, 2, 3 и 4 месяца. Каждой опытной соответствовала контрольная группа, помещаемая в камеру на тот же срок, но без ССГ. Учитывая статистически не значимые различия показателей между контрольными группами, для удобства восприятия в таблицах приводятся референтные значения контрольной группы, обследованной до начала эксперимента [4].
Забор крови производился под общим наркозом (тиопентал натрия, 40 мг/1 кг массы по Г.Е.Батрак, А.Н.Кудрину, 1979) однократно у крыс по мере окончания затравочных периодов, соответствующих одному (группа 1), двум (группа 2), трем (группа 3) и четырем (группа 4) месяцам из брюшной аорты (pars abdominalis aortae) и из задней полой вены (vena cavacaudalis) (Н.Н.Карташев и соавт., 1981). Кровь изучалась по 12 показателям коагулограммы с учетом артерио-венозной разницы с помощью диагностических наборов тест-систем ООО «Технология стандарт» (Барнаул) по показателям индуцированной агрегации, уровню растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК), D-димера (BioMerieux), фактору VIII (фVIII), протеину С, XIIа-зависимому эуглобулиновому лизису (XIIа-ЭЛ). Число тромбоцитов и общее время свертывания проводили по стандартным лабораторным методикам [2]. Активность фактора Виллебранда (fW), ингибитора активатора плазминогена-1 (ИТАП-1) (Dade Behring Inc), а также содержание антитромбина III и плазминогена определяли с помощью спектрофотометра (ПЭ-5400В, ООО «ПромЭкоЛаб», Россия). Клеточное звено изучали по показателям числа и индуцированной агрегации («Агрескин-тест»). Материалы обрабатывали в OpenOffice Calc, OpenOffice (Ver. 3.0) и прикладной программе SPSS Statistics 21 (Windows 10). В таблицах представлены средние арифметические величины (М), стандартное отклонение (s), и вероятность различия (р). Нормальность распределения определялась по критерию Колмогорова–Смирнова. Результаты считали достоверными при уровне статистической значимости различий от p<0,05 до p<0,001.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты гемостазиологического исследования выявили изменения, позволившие разделить единый период хронического эксперимента на 2 периода: ранний (первые 2 месяца) и поздний (3 и 4 месяцы). На протяжении первых двух месяцев ингаляции ССГ отмечался количественный (p<0,05) и функциональный спад уровня активности тромбоцитов (p<0,05). Общая коагуляционная активность плазменных факторов свертывания была ниже контрольных величин. Так, увеличились общее время свертывания (ВС) (p<0,05) и активность антикоагулянта протеина С (p<0,001) по сравнению с группой контроля. Максимально возросла скорость Хагеман-зависимого эуглобулинового лизиса (Хагеман-ЭЛ), особенно во второй опытной группе (p<0,05) (табл. 1).
Таблица 1
Показатели свертываемости венозной и артериальной крови у экспериментальных животных при хроническом (1-2 месяца) воздействии сероводородсодержащим газом в концентрации 70 мг/м3 (M±s)
|
Показатели |
Венозная кровь |
Артериальная кровь |
||||
|
Контроль |
Опытная группа 1 |
Опытная группа 2 |
Контроль |
Опытная группа 1 |
Опытная группа 2 |
|
|
PLT ×109/l |
758±5,45 |
741±5,38 |
717±5,46* |
769±6,78 |
757±6,65 |
743±5,76* |
|
ИАТ, % |
100±5,34 |
76±0,79° |
88±1,99*° |
100±4,90 |
74±3,89° |
85±1,86*° |
|
ВС, мин |
5,9±0,76 |
6,3±0,65° |
7,1±0,54*° |
5,95±0,67 |
6,4±0,56° |
8,5±0,61*° |
|
РФМК, мг/100 мл |
3,8±0,12 |
3,8±0,12# |
4,0±0,76 |
3,2±0,11 |
3,2±0,12 |
3,5±0,66 |
|
D-димер, % особей |
abs |
abs |
3 (21,4%)*° |
abs |
abs |
3 (21,4%)*¤ |
|
XIIа-ЭЛ, мин |
7,7±0,45 |
6,4±0,54*# |
6,9±0,90* |
7,9±0,65 |
6,3±0,66¤ |
7,1±0,93*¤ |
|
fW, % |
94,1±1,45 |
94,9±1,56 |
95,1±1,49 |
96,2±1,76 |
97,1±1,68 |
98,6±1,56 |
|
ФVIIIа, % |
85,4±1,32 |
85,3±1,35 |
85,2±2,31 |
85,6±1,56 |
85,5±1,34 |
85,9±2,34 |
|
Антитробин III, % |
117,2±4,56 |
116,2±4,67# |
112,3±4,47# |
103,1±4,78 |
101,8±4,86 |
98,2±4,11# |
|
Протеин С, Ед |
0,6±0,05 |
0,71±0,06*## |
0,76±0,03***# |
0,7±0,04 |
0,94±0,07** |
0,97±0,04***# |
|
Плазминоген, % |
79,5±1,67 |
79,3±1,87 |
78,1±1,95 |
79,3±1,67 |
79,1±1,35 |
78,9±1,96 |
|
ИТАП-1, Ед/мл |
2,7±0,21 |
2,7±0,23° |
3,1±0,77*° |
2,75±0,34 |
2,79±0,39° |
3,2±0,78*¤ |
Примечание: * – уровень статистической значимости между показателями опытной и контрольной групп (* – p<0,05, ** – p<0,01, *** – p<0,001); # – уровень статистической значимости между показателями опытных (вена/артерия) групп (p<0,05); ° – уровень статистической значимости между показателями опытных (2 месяца / 1 месяц) групп (p<0,05).
Оценка роли легких проводилась на основе артерио-венозной разницы показателей системы гемостаза. Содержание РФМК возрастало на всем протяжении эксперимента (p<0,05). Регистрировалась тенденция к преобладанию РФМК в венозной крови над артериальной (p<0,05) только в течение первого месяца эксперимента. Это указывает на активацию системы лизиса фибрина, но фильтрацию в последующем легкими данных промежуточных продуктов. Содержание РФМК в крови «после легких» характеризовалось резким приростом на четвертом месяце, уменьшая артерио-венозную разницу с доэкспериментальным периодом.
Уровень антитромбина III понижался к концу четвертого месяца (p<0,05). Максимальная артерио-венозная разница по данному показателю отмечена во втором месяце, где он достоверно больше в венозной плазме (p<0,05). К концу эксперимента разница уменьшалась (табл. 2).
Скорость фибринолиза замедлялась в первую очередь в венозной крови (p<0,05) по сравнению с артериальной через один месяц ингаляции ССГ. Это свидетельствует о сохраняемой способности эндотелия сосудов легких синтезировать активаторы плазминогена. В течение всего периода воздействия ССГ фиксировалось уменьшение уровня плазминогена, достигнув минимального значения к концу эксперимента (p<0,05) по сравнению с контролем, что говорит о высоком потреблении данного фактора в процессе глобальной активации системы гемостаза.
Активность ИТАП-1 возрастала к четвертому опытному месяцу (p<0,001) без существенной артерио-венозной разницы (табл. 2).
Таблица 2
Показатели свертываемости венозной и артериальной крови у экспериментальных животных при хроническом (3-4 месяца) воздействии сероводородсодержащим газом в концентрации 70 мг/м3 (M±s)
|
Показатели |
Венозная кровь |
Артериальная кровь |
||||
|
Контроль |
Опытная группа 3 |
Опытная группа 4 |
Контроль |
Опытная группа 3 |
Опытная группа 4 |
|
|
PLT ×109/l |
758±5,45 |
673±4,11* |
615±4,53* |
769±6,78 |
689±4,49* |
629±4,54* |
|
ИАТ, % |
100±5,34 |
94 ±3,29°° |
121±3,48**°° |
100±4,90 |
92±3,25°° |
116,4±3,41*°° |
|
ВС, мин |
5,9±0,76 |
5,7±0,32 |
5,1±0,61* |
5,95±0,67 |
5,68±0,30 |
5,2±0,62* |
|
РФМК, мг/100 мл |
3,8±0,12 |
4,2±0,54* |
4,5±0,47* |
3,2±0,11 |
3,9±0,46*° |
4,3±0,45***° |
|
D-димер, % особей |
abs |
7 (58,3%)° |
9 (90%)***° |
abs |
6 (50%)° |
8(80%)***° |
|
XIIа-ЭЛ, мин |
7,7±0,45 |
7,9± 0,45*° |
9,0±0,97*° |
7,9±0,65 |
8,1±0,51* |
8,8±0,96* |
|
fW, % |
94,1±1,45 |
107,4±3,99* |
110,4±2,67* |
96,2±1,76 |
109,4±3,61* |
116,6±2,68* |
|
ФVIIIа, % |
85,4±1,32 |
94,8± 2,45* |
100,9±2,36* |
85,6±1,56 |
95,1±2,46* |
101,4±2,37* |
|
Антитробин III, % |
117,2±4,56 |
93,7±3,31**° |
86,8±2,98**° |
103,1±4,78 |
92,4±3,30* |
85,1±2,97* |
|
Протеин С, Ед |
0,6±0,05 |
0,69±0,02*##°° |
0,53±0,02*#°° |
0,7±0,04 |
0,83±0,04**##°° |
0,59±0,02*#°° |
|
Плазминоген, % |
79,5±1,67 |
70,9±1,43* |
64,3±1,41* |
79,3±1,67 |
70,7±1,41* |
64,8±1,42* |
|
ИТАП-1, Ед/мл |
2,7±0,21 |
3,6±0,71**° |
4,3±1,21***° |
2,75±0,34 |
3,7±0,72**° |
4,35±1,22***° |
Примечание: * – уровень статистической значимости между показателями опытной и контрольной групп (* – p<0,05, ** – p<0,01, *** – p<0,001); # – уровень статистической значимости между показателями опытных (вена/артерия) групп (p<0,05); ° – уровень статистической значимости между показателями опытных (4 месяца / 3 месяца) групп (° – p<0,05, °° – p<0,01).
Содержание плазминогена снижалось к концу эксперимента как в артериальной (p<0,05), так и венозной плазме (p<0,05), указывая на потребление фактора в условиях активного фибринолиза, что привело к постепенному истощению системы к четвертому месяцу.
К концу опытного периода возросло содержание поздних продуктов деградации фибрина – D-димера (p<0,05). Причем, преимущественно рост отмечен в венозной крови (p<0,05), что указывает на сохранение в определенной степени фильтрационной функции легких (табл. 2).
Отмечался рост уровня фVIII (p<0,05) и фактора Виллебранда (p<0,05) по мере продолжительности хронического воздействия ССГ без существенной артериo-венозной разницы.
Гипокоагуляционный потенциал крови, зафиксированный по замедлению общего времени свертывания плазмы, обусловлен в артериальной крови преимущественно за счет высокой активности протеина С, активируемого комплексом тромбин+тромбомодулин. По данным литературы, синтез тромбомодулина преобладает в артериях. Воздействие ССГ уже на раннем этапе воздействия стимулирует систему гемостаза в глобальном смысле, что означает и прокоагуляцию и фибринолиз. Но образующийся в малом количестве тромбин инактивируется тромбомодулином с одной стороны (в артериальной плазме) и антитромбином III – с другой. Последний фактор – достаточно сильный антикоагулянт, что позволяет ему сохранять свою активность вплоть до венозного кровотока. Синтезируемый эндотелием ИТАП-1 сначала поглощался тромбоцитами, не оказывая, таким образом, ингибирующего влияния на активатор плазминогена. Известно, что если индуктора агрегации недостаточно для стимуляции метаболизма арахидоновой кислоты и тромбоцитарной секреции, через некоторое время происходит частичная диссоциация связанного с пластинками фибриногена и развивается процесс дезагрегации. Возможно, этим можно объяснить один из механизмов гипоагрегации в первые два месяца хронической ингаляции ССГ.
Выводы
- По мере увеличения периода экспозиции сероводородсодержащего газа (70±2,34 мг/м3) у крыс увеличивается степень повреждения эндотелия капилляров легких (возросший фактор Виллебранда и ингибитор активатора плазминогена-1), что влияет на его синтетическую и фильтрационную функции.
- О снижении синтетической функции эндотелия капилляров сосудов легких в условиях дыхания сероводородсодержащим газом свидетельствуют замедление скорости фибринолиза, уменьшения плазминогена и рост ингибитора плазминогена-1, позволяющие констатировать снижение производства активаторов плазминогена.
- О повреждении барьерной способности легочного сосудистого эндотелия говорит увеличение уровня растворимых фибрин-мономерных комплексов на фоне нивелирования их артерио-венозной разницы.
- Гемостазрегулирующая функция легких отражается в артерио-венозной разнице состояния компонентов системы гемостаза. В частности, в артериальной плазме выше активность протеина С, скорость фибринолиза, а содержание антитромбина III – в венозной. К концу эксперимента, через четыре месяца хронического воздействия сероводородсодержащего газа, отличия по содержанию и активности компонентов системы гемостаза уменьшились, в целом, на фоне роста прокоагулянтного потенциала плазмы крови.
1. Абдуганиева Э.А., Ливерко И.В. Иммунологический профиль и коагуляционный гемостаз при коморбидности хронической обструктивной болезни лёгких и ишемической болезни сердца. Есть ли связь? // Медицинский академический журнал. 2016. Т.16, №4. С.142–143.
2. Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед, 2008. 292 с.
3. Кузник Б.И. Развитие идей Д.М.Зубаирова Читинской школой гемостазиологов // Казанский медицинский журнал. 2015. Т.96, №5. С.709–715.
4. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / под ред. Н.Н.Каркищенко, С.В.Грачева. М.: Профиль-2С, 2010. 358 с.
5. Тризно Н.Н, Голубкина Е.В., Тризно М.Н., Дюкарева О.С. Состояние системы гемостаза у крыс после хронической интоксикации сероводородсодержащим газом // Современные проблемы науки и образования. 2017. №4. URL: http://science-education.ru/ru/article/viewid =26683 (дата обращения: 23.07.2018).
6. Шпагин И.С., Герасименко О.Н., Шпагина Л.А. Системный гемостаз и ремоделирование сосудов при кардиореспираторной патологии: подходы к лечению // Медицина и образование в Сибири. 2013. №3. C.10. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/sistemnyy-gemostaz-i-remodelirovanie-sosudov-pri-kardiorespiratornoy patologii-podhody-k-lecheniyu (дата обращения: 23.07.2018).
7. Ярошинская А.П., Лазько А.Е., Зиндан С. Влияние серосодержащего газа на дренажную функцию системы микроциркуляции // Морфология. 2016. Т.149, №3. С.249.
8. Glas G.J., Van Der Sluijs K.F., Schultz M.J., Hofstra J.J., Van Der Poll T., Levi M. Bronchoalveolar hemostasis in lung injury and acute respiratory distress syndrome // J. Thromb. Haemost. 2012. Vol.11, №1. P.17–25. doi: 10.1111/jth.12047
9. Gordeeva O.B., Botvinieva V.V., Simonova O.I., Namazova-Baranova L.S., Gorinova Y.V., Vashakmadze N.D., Gevorkyan A.K. Specifics of platelet hemostasis in children with chronic diseases of lungs // Open Access Library Journal 2016. Vol.3, №4. P.1–6. doi: 10.4236/oalib.1102324
10. Guidotti T.L. Hydrogen sulfide intoxication // Handb. Clin. Neurol. 2015. Vol.131. P.111–133. doI: 10.1016/B978-0-444-62627-1.00008-1
11. Lambrecht B.N. Hammad H. Asthma and coagulation // N. Engl. J. Med. 2013. Vol.369, №20. P.1964–1966. doi: 10.1056/NEJMcibr1311045
12. Shimamoto K., Hanaoka K. Fluorescent probes for hydrogen sulfide (H2S) and sulfane sulfur and their applications to biological studies // Nitric Oxide. 2015. Vol.46. P.72–79. doi: 10.1016/j.niox.2014.11.008
13. Tucker T., Idell S. Plasminogen-plasmin system in the pathogenesis and treatment of lung and pleural injury // Semin. Thromb. Hemost. 2013. Vol.39, №4. P.373–381. doi: 10.1055/s-0033-1334486
14. Versteeg H.H., Heemskerk J.W., Levi M., Reitsma P.H. New fundamentals in hemostasis // Physiol. Rev. 2013. Vol.93, №1. P.327–358. doi: 10.1152/physrev.00016.2011
