РЕФЕРЕНСНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ФИЗИОЛОГО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГИДРОБИОНТОВ РАЗНЫХ ВИДОВ
Журнал: ВЕСТНИК АСТРАХАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ТЕХНИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ: РЫБНОЕ ХОЗЯЙСТВО
Том 2015 № 4
, 2015
Рубрики: ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ГИДРОБИОНТОВ
Авторы:
1.
Всероссийский научно-исследовательский институт ирригационного рыбоводства
2.
Всероссийский научно-исследовательский институт ирригационного рыбоводства
Тип:
Статья
Страницы:
с 103
по 108
Статус:
Опубликован
Получено:
05.12.2015
Одобрено:
15.01.2023
Опубликовано:
25.12.2015
Классификаторы:
УДК 639.3:575.224
ГРНТИ 34.39 Физиология человека и животных
ГРНТИ 62.13 Биотехнологические процессы и аппараты
ГРНТИ 69.01 Общие вопросы рыбного хозяйства
ГРНТИ 69.25 Аквакультура. Рыбоводство
ГРНТИ 69.31 Промышленное рыболовство
ГРНТИ 69.51 Технология переработки сырья водного происхождения
ГРНТИ 87.19 Загрязнение и охрана вод суши, морей и океанов
ГРНТИ 34.39 Физиология человека и животных
ГРНТИ 62.13 Биотехнологические процессы и аппараты
ГРНТИ 69.01 Общие вопросы рыбного хозяйства
ГРНТИ 69.25 Аквакультура. Рыбоводство
ГРНТИ 69.31 Промышленное рыболовство
ГРНТИ 69.51 Технология переработки сырья водного происхождения
ГРНТИ 87.19 Загрязнение и охрана вод суши, морей и океанов
Язык материала:
русский
Ключевые слова:
рыбы, речные раки, физиологическое состояние, иммунный статус, гематологические, биохимические, цитохимические показатели
Аннотация (русский):
Цель исследований - определение референсных значений показателей крови рыб и гемолимфы речных раков - как продолжение исследований по расширению методической составляющей физиолого-иммунологической оценки гидробионтов. Объектами исследования являлись рыбы: карповые ( Cyprinidae ), сомовые ( Siluridae ), осетровые ( Acipenseridae ), щуковые ( Esocidae ); речные раки: длиннопалый ( Pontastacus leptodactylus) и широкопалый ( Astacus astacus ) . Пробы циркулирующих жидкостей отбирали in vivo с сохранением жизни и здоровья гидробионтов: кровь - из хвостовой вены рыб; гемолимфу - из вентрального синуса речных раков. Определялись гематологические показатели: гемоцитарная и лейкоцитарная формула. Иммунологические показатели (кислороднезависимые факторы клеточного иммунитета) оценивались по содержанию катионного лизосомального белка в фагоцитах цитохимическим способом, адаптированным для пойкилотермных гидробионтов. Биохимические показатели (содержание общего белка и фракций, глюкозы, креатинина, холестерола), активность ряда ферментов (аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, креатинкиназа) в сыворотке крови рыб определяли на анализаторе Chem Well Awarenes Technology с использованием реактивов Vital. Гемолимфу речных раков перед биохимическими исследованиями центрифугировали при 3000 об/мин и температуре +6 °С в течение 5 минут. В результате исследований определены диапазоны изменений показателей для гидробионтов разных видов и представлены референсные значения. Отмечена высокая пластичность большинства показателей. У пойкилотермных гидробионтов синтетические и катаболические реакции активно протекают в широком диапазоне значений температуры.
Цель исследований - определение референсных значений показателей крови рыб и гемолимфы речных раков - как продолжение исследований по расширению методической составляющей физиолого-иммунологической оценки гидробионтов. Объектами исследования являлись рыбы: карповые ( Cyprinidae ), сомовые ( Siluridae ), осетровые ( Acipenseridae ), щуковые ( Esocidae ); речные раки: длиннопалый ( Pontastacus leptodactylus) и широкопалый ( Astacus astacus ) . Пробы циркулирующих жидкостей отбирали in vivo с сохранением жизни и здоровья гидробионтов: кровь - из хвостовой вены рыб; гемолимфу - из вентрального синуса речных раков. Определялись гематологические показатели: гемоцитарная и лейкоцитарная формула. Иммунологические показатели (кислороднезависимые факторы клеточного иммунитета) оценивались по содержанию катионного лизосомального белка в фагоцитах цитохимическим способом, адаптированным для пойкилотермных гидробионтов. Биохимические показатели (содержание общего белка и фракций, глюкозы, креатинина, холестерола), активность ряда ферментов (аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, креатинкиназа) в сыворотке крови рыб определяли на анализаторе Chem Well Awarenes Technology с использованием реактивов Vital. Гемолимфу речных раков перед биохимическими исследованиями центрифугировали при 3000 об/мин и температуре +6 °С в течение 5 минут. В результате исследований определены диапазоны изменений показателей для гидробионтов разных видов и представлены референсные значения. Отмечена высокая пластичность большинства показателей. У пойкилотермных гидробионтов синтетические и катаболические реакции активно протекают в широком диапазоне значений температуры.
Ключевые слова:
рыбы, речные раки, физиологическое состояние, иммунный статус, гематологические, биохимические, цитохимические показатели
рыбы, речные раки, физиологическое состояние, иммунный статус, гематологические, биохимические, цитохимические показатели
Введение Для увеличения выхода товарной продукции в рыбоводных хозяйствах необходим контроль физиологического состояния выращиваемой рыбы или речных раков. С этой целью проводятся различные исследования, результаты которых необходимо рассматривать комплексно. Для оценки результата анализа необходимы определенные сведения об объекте исследования - референсные значения. «Нормальный» результат должен попадать в диапазон референсных значений, определенных для соответствующей группы организмов, которые выделены по таким показателям, как пол, возраст и др. При оценке всех клинико-лабораторных показателей результаты, полученные для данного организма, сравнивают с так называемым «референсным диапазоном» (или «нормой»), полученным в результате обследования большого количества здоровых особей. Безусловно, иногда результаты, выходящие за пределы референсного диапазона, свидетельствуют о заболевании. Однако референсные значения могут зависеть от качества анализа, а также во многом зависят от вида, пола, возраста и других показателей и могут варьировать в широких пределах в одной группе. Так, С. В. Холодкевич с соавторами [1], в результате многочисленных экспериментов на бентосных беспозвоночных (речные раки (Astacus astacus, Pontastacus leptodactylus) и моллюски (Mytilus edulis L., Mytilus galloprovincialis Lam., Littorina littorea L. и др.)), установили, что индивидуальные различия в ответах тест-животных, отобранных по указанным общепринятым показателям, могут достигать 40-50 % по характеристикам кардиоактивности (частоты сердечных сокращений) и общему белку гемолимфы. Вследствие этого для разных групп должны быть получены различные референсные диапазоны. Ориентируясь на референсные значения физиолого-иммунологических показателей гидробионтов, можно определить физиологическое состояние и иммунный статус исследуемой группы рыб или речных раков. Используемые в рыбоводной практике методы оценки физиологического состояния рыб не дают исчерпывающей информации о метаболизме и состоянии иммунной системы, сложны, трудоемки и затратны [2-5]. Полной физиолого-иммунологической оценки речных раков не проводилась. Нами была предложена методика клинической лабораторной диагностики гидробионтов, которая является прижизненной, что позволяет сохранять объекты исследования живыми в процессе выращивания и селекционно-племенной работы [6]. Преимуществом данной методики является также то, что в ней используется комплекс наиболее информативных показателей, необходимых и достаточных для оценки состояния здоровья пойкилотермных обитателей водной среды. В то же время мы выбрали методы исследования, не перегружающие и не усложняющие работу и доступные для практического использования в аквакультуре. Целью настоящей работы являлось определение референсных значений показателей крови рыб и гемолимфы речных раков - как продолжение исследований по расширению методической составляющей физиолого-иммунологической оценки гидробионтов. Материалы и методы исследования Объектами исследования являлись рыбы: карповые (Cyprinidae), сомовые (Siluridae), осетровые (Acipenseridae), щуковые (Esocidae); речные раки: длиннопалый (Pontastacus leptodactylus) и широкопалый (Astacus astacus). Кровь для анализа отбирали из хвостовой вены рыб. Получение гемолимфы раков in vivo осуществляли методом пункции вентрального синуса. Референсные значения определяли следующими способами: - гематологические - методами дифференциального подсчета показателей гемопоэза, лейкоцитарной формулы рыб, гемоцитарной формулы речных раков; - иммунологические - цитохимическим методом по среднему цитохимическому коэффициенту (СЦК) лизосомального катионного белка в нейтрофилах крови рыб и гемоцитах речных раков в реакции с бромфеноловым синим [7], адаптированным для гидробионтов Г. И. Прониной [8], СЦК рассчитывался для рыб (речных раков) по формуле СЦК = [0 · Н0(Г0) + 1 · Н1(Г1) + 2 · Н2(Г2) + 3 · Н3(Г3)]/100, где Н0(Г0), Н1(Г1), Н2(Г2), Н3(Г3), % - количество нейтрофилов рыб (гемоцитов речных раков) с активностью 0, 1, 2 и 3 балла соответственно; - биохимические - на анализаторе Chem Well Awarenes Technology с использованием реактивов Vital: содержание общего белка и фракций, глюкозы, креатинина, холестерола), активность ряда ферментов (аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), креатинкиназа (КК)) в сыворотке крови. Статистическая обработка результатов осуществлялась методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента. Достоверными считались различия при p ≥ 0,05. Результаты исследований и их обсуждение Гемопоэз у рыб имеет ряд особенностей. В частности, у них больше органов гемопоэза, чем у высших позвоночных (млекопитающих), поэтому в крови рыб в норме содержится определенной количество бластных форм эритроцитов. К органам гемопоэза у рыб относятся: жаберный аппарат (эндотелий сосудов и ретикулярный синцитий, сосредоточенный у основания жаберных лепестков), кишечник (слизистая), сердце (эпителиальный слой и эндотелий сосудов), почки (ретикулярный синцитий между канальцами), селезёнка, сосудистая кровь, лимфоидный орган (скопления кроветворной ткани - ретикулярного синцития - под крышей черепа). Наиболее филогенетически древним неспецифическим врожденным фактором иммунной защиты является фагоцитоз. Одной из систем, обеспечивающих биоцидность фагоцитов, являются кислороднезависимые механизмы, к которым относятся специфические катионные белки. В ходе исследований показано, что СЦК лизосомального катионного белка в фагоцитах является индикатором биоцидности циркулирующих жидкостей гидробионтов и позволяет судить о состоянии их клеточного иммунитета. Наш выбор биохимических показателей для физиологической оценки гидробионтов разных видов был обусловлен следующими причинами. Аминотрансферазы играют ключевую роль в обмене веществ, объединяя в единое целое белковый, углеводный, жировой обмен. Учитывая исключительную роль этих ферментов в обмене веществ клетки, их активность целесообразно использовать в качестве биохимического индикатора физиологического статуса. Альбумины сыворотки отражают субстратную обеспеченность анаболических процессов организма и напряженность пластического обмена. Показатель доли альбуминов является одним из оценочных критериев адаптационных возможностей и жизнестойкости организма. Уровень глюкозы в крови является мягкой константой гомеостаза у гидробионтов. Повышенное содержание глюкозы в крови свидетельствует об интенсивном распаде гликогена печени либо об относительно малом использовании глюкозы тканями, а пониженное ее содержание - об исчерпании запасов гликогена печени либо интенсивном использовании глюкозы тканями организма. По изменению содержания глюкозы в крови судят о скорости ее аэробного окисления в тканях организма при мышечной деятельности и интенсивности мобилизации гликогена печени. Щелочная фосфатаза катализирует процесс отщепления фосфорорганического остатка от органических доноров. Во многих случаях содержание щелочной фосфатазы увеличивается не за счет механического накопления и высвобождения в кровь, а связано с нейрогенной или хронической индукцией ее синтеза. Нами отмечена обратная корреляция активности фермента с массой тела рыб, что можно использовать в селекционной работе с гидробионтами. Кроме того, отмечается видоспецифичность фермента. Креатинин является катаболитом макроэргического обмена, преимущественно, в мышечной ткани. Отклонения уровня креатинина от нормы, как правило, свидетельствуют о нарушении функции почек, высокой мышечной активности, или деструктивных изменениях мышечной ткани. Активность креатинкиназы в сыворотке крови в паре с показателем концентрации креатинина является информативным диагностическим тестом при различных заболеваниях, является отражением напряженности энергетического обмена в мышцах. Холестерол обеспечивает стабильность клеточных мембран в широком интервале температур, что особенно важно для пойкилотермных организмов, к которым относятся рыбы и речные раки.* Нами выявлено, что у всех исследуемых видов рыб показатели гемопоэза различаются незначительно и в большей степени зависят от состояния их организма и сезона года (табл. 1). Таблица 1 Физиологические изменения гематологических, цитохимических и биохимических показателей рыб Показатель Вид рыб Карп Линь Язь Сом Русский осетр Стерлядь Щука Показатели эритропоэза, % Гемоцитобласты, эритробласты 0-2 0,5-1,5 - 0-2 0,5 - - Нормобласты 0,5-7 2-3,5 2-3 0-6 4,5 2-4 2-3 Базофильные эритроциты 5-19 3-8 7-9 2-20 8-11 10-20 5-7 Сумма зрелых и полихроматофильных эритроцитов 77-92 89-91 87-91 75-98 83-87 80-83 89-92 Лейкоцитарная формула, % Миелобласты 0-0,4 - - - - - - Промиелоциты 0-0,4 0,3-1,8 0-0,5 0-2 0-2 0-1,5 0-1,2 Миелоциты 0-3 0-0,5 1-2 0-2 0-0,5 1-2,5 1-3 Метамиелоциты 0-8 0-1 1-3 1-6 2-4 0-1 0-2 Палочкоядерные нейтрофилы 0-10 1-8 2-5 0-18 0-3 2-5 1-3 Сегментоядерные нейтрофилы 0-9 2-5 1-7 0-20 1-4 1-4 2-4 Эозинофилы 0-1 - - 0-2 - - - Базофилы 0-1 0-3 - 0-2 - - - Моноциты 0-8 1-5 1-4 0-5 2-4 3-6 2-4 Лимфоциты 78-93 79-91 80-92 73-96 85-90 82-89 86-93 Фагоцитарная активность нейтрофилов СЦК, ед. 1,5-2,1 1,6-1,9 1,4-2,0 1,5-2,2 1,5-1,9 1,6-2,1 1,6-1,9 Биохимические показатели Общий белок, г/дл 14-35 25-40 20-25 20-25 Альбумин, г/дл 5-18 14-17 14-18 14-19 Глюкоза, ммоль/л 2-5 6-12 1-20 1-3 2-4 4-9 АЛТ, ед./л 16-58 30-50 25-60 32-70 40-80 50-110 АСТ, ед./л 82-650 330-350 250-300 83-570 230-270 250-310 210-320 ЩФ, ед./л 9-120 36-50 56-75 3-25 100-190 90-160 45-55 КК, ед./л 90-5000 3000-3200 35-500 1300-3700 2300-2800 2300-2800 3500-3700 Креатинин, мкмоль/л 3-15 6-13 5-12 7-13 25-40 Холестерол, мг/дл 90-140 90-170 68-210 50-80 50-80 90-170 Для рыб характерен лимфоцитарный профиль - основу белой крови составляют лимфоциты, доля которых в общем пуле лейкоцитов не опускается ниже 70 % и не превышает 94 %. Рост доли гранулярных лейкоцитов свидетельствует о неблагополучии рыб с различной этиологией (воспаление, инфекция, инвазия, аллергия). Нами выявлены различия в соотношении разных форм гемоцитов в гемолимфе широкопалого и длиннопалого речных раков при изменениях условий среды (табл. 2). Таблица 2 Средние гематологические, биохимические и цитохимические показатели гемолимфы речных раков Показатель Вид речного рака Astacus astacus Pontastacus leptodactylus Общее число грибов, шт./мкл 250-1200/725* 300-1300/800 Гемоцитарная формула, % Агранулоциты 20-45/32,5 20-45/32,5 Полугранулоциты 20-50/35 20-50/35 Гранулоциты 20-45/32,5 20-45/32,5 Прозрачные клетки 0,5-15/6,5 0,3-15/5,5 Биохимические показатели Глюкоза, ммоль/л 2-7/4,5 0,2-3/1,6 АЛТ, ед./л 50-170/80 50-170/80 АСТ, ед./л 50-170/120 50-170/120 ЩФ, ед./л 10-25/17,5 30-90/60 Фагоцитарная активность гемоцитов СЦК, ед. 1,5-2,0/18,5 1,5-2,0/18,9 * В числителе референсные пределы, в знаменателе - средние значения. В частности, недостаток кальция в воде и повышение содержания нитратов и нитритов вызывают уменьшение доли гранулоцитов и возрастание относительной доли ювенильных форм гемоцитов. При транспортном стрессе растет доля агранулоцитов на фоне снижения фагоцитов - полугранулоцитов. Представленные гематологические показатели являются индикаторами состояния рыбы, что позволяет использовать их при физиолого-иммунологической оценке. Заключение Количество показателей лабораторных исследований, для которых установлены стандартные референсные значения, невелико. Нами определены референсные значения следующих показателей: гематологических (показатели эритропоэза, лейкоцитарная формула крови рыб и гемоцитарная формула гемолимфы речных раков), цитохимических (содержание лизосомального катионного белка в фагоцитах циркулирующих жидкостей гидробионтов) и биохимических (содержание субстратов в циркулирующих жидкостях: глюкозы, общего белка и альбуминов, креатинина, холестерола; активность ферментов: аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинкиназы). Значения показателей являются критериями физиологического состояния гидробионтов в процессе культивирования и селекционной работы. Оценивая коридор изменений химических констант гомеостаза рыб и речных раков, следует подчеркнуть высокую пластичность большинства показателей. У пойкилотермных гидробионтов синтетические и катаболические реакции активно протекают в широком диапазоне значений температуры.
1. Холодкевич С. В. Методические подходы к формированию референтных групп бентосных беспозвоночных на основе комплекса оценок их функционального состояния / С. В. Холодкевич, Т. В. Кузнецова, С. В. Сладкова, Г. П. Удалова, В. А. Любимцев // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Экологическая физиология и биохимия водных организмов. Петрозаводск: КарНЦ РАН, 2010. Т. 1. C. 297-303.
2. Вихман А. А. Системный анализ иммунофизиологической реактивности рыб в условиях аквакультуры / А. А. Вихман. М.: Экспедитор, 1996. 176 с.
3. Микряков В. Р. Актуальные вопросы иммунологии рыб / В. Р. Микряков // Теоретические аспекты рыбохозяйственных исследований водохранилищ. Л.: Наука, 1978. С. 116-133.
4. Методические указания по определению уровня естественной резистентности и оценке иммунного статуса рыб. Утверждены департаментом ветеринарии от 25.11.1999. № 113-4-2/1795.
5. Серпунин Г. Г. Гематологические показатели адаптаций рыб: автореф. дис. … д-ра биол. наук / Г. Г. Серпунин. Калининград, 2002. 49 с.
6. Иванов А. А. Клиническая лабораторная диагностика в аквакультуре. Методические указания / А. А. Иванов, Г. И. Пронина, Н. Ю. Корягина, А. Б. Петрушин. М.: Изд-во ТСХА, 2013. 50 с.
7. Шубич М. Г. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего / М. Г. Шубич // Цитология. 1974. № 10. С. 1321-1322.
8. Пронина Г. И. Физиолого-иммунологическая оценка культивируемых гидробионтов: карпа, сома обыкновенного, речных раков: дис. … д-ра биол. наук / Г. И Пронина. М.: РГАУ МСХА им. К.А. Тимирязева, 2012. 246 с.
