Текст произведения
(PDF):
Читать
Скачать
Введение Среди антропогенных факторов, влияющих на функционирование водных экосистем, важная роль принадлежит ксенобиотикам, количество которых увеличивается с ростом уровня антропогенного загрязнения. Одним из представителей таких веществ является глифосат. На основе его изопропиламиновой соли создано много гербицидов, самый известный из которых – Раундап. Он широко используется для уничтожения сорной растительности на полях, в коллекторно-дренажных каналах, оросительных системах и прудах. Период полураспада глифосата в водной среде варьирует от 7 до 14 дней [1], в его разрушении активное участие принимает микробиота [2]. Несмотря на заявленную производителем (фирма «Монсанто», США) безопасность препарата для водных организмов, в последние годы накоплено большое количество данных о токсичности Раундапа для беспозвоночных и рыб [3–6]. Раундап в концентрациях 0,004-10,0 мг/л снижает продуктивность и линейные размеры ветвистоусых рачков [7], оказывает влияние на размножение и развитие моллюсков [4], вызывает нарушения морфологических и физиолого-биохимических показателей у рыб [8–11]. В наших экспериментах установлено, что Раундап в концентрации 0,1–50,0 мкг/л (по глифосату) изменяет амилолитическую и сахаразную активность в слизистой оболочке, содержимом кишечника и в целом организме молоди рыб в условиях in vitro (температура 20 °С, рН 7,4) [12]. Активность одноименных ферментов в организме беспозвоночных в присутствии Раундапа изменяется как в условиях in vitro, так и in vivo [7, 13]. В то же время влияние важнейших абиотических факторов – температуры и рН, на активность пищеварительных гликозидаз рыб и их кормовых объектов в присутствии Раундапа до сих пор не изучено. Цель работы состояла в изучении in vitro влияния гербицида Раундап на амилолитическую активность в кишечнике молоди рыб, а также в целом организме беспозвоночных животных при различных значениях температуры и рН. Материалы и методы исследования Объекты исследования – молодь пресноводных костистых рыб: окунь Perca fluviatilis L.: 0,63 ± 0,05 г, 4,02 ± 0,09 см, тюлька Сlupeonella cultriventris (Nord.): 0,55 ± 0,03 г, 3,72 ± 0,04 см, карп Cyprinus carpio (L.): 1,33 ± 0,15 г, 4,03 ± 0,14 см, а также беспозвоночные животные: рачковый зоопланктон (суммарные пробы, включающие представителей отр. Dafniiformes, Copepoda и Ostracoda), личинки хирономид Chironomus plumosus (L.) и дрейссена Dreissena polymorpha (Pall.). Рыб и беспозвоночных животных отлавливали в прибрежной зоне Рыбинского водохранилища в летний период и в течение 1-2 часов доставлялись в лабораторию. Амилолитическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал – a-амилазы КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы КФ 3.2.1.3 и мальтазы КФ 3.2.1.20 – определяли в гомогенатах слизистой оболочки медиального отдела кишечника рыб или целого организма беспозвоночных модифицированным методом Нельсона [14]. Животных помещали на стекло ледяной бани, у рыб извлекали кишечник, у моллюсков предварительно удаляли раковину. При помощи стеклянного гомогенизатора готовили суммарные пробы, включающие нескольких сотен рачков, несколько десятков хирономид или моллюсков или 10-20 экз. молоди рыб, добавляя охлажденный до 2–4 °С раствор Рингера для холоднокровных животных (110 ммоль NaCl, 1,9 ммоль KCl, 1,3 ммоль CaCl2, pH 7,4) в соотношении 1 : 9. Затем исходный гомогенат дополнительно разводили раствором Рингера в 2-10 раз. Раствор крахмала (18 г/л), используемый в качестве субстрата, готовили на таком же растворе Рингера. Инкубацию гомогенатов и субстратов проводили в течение 30 минут в 18 вариантах экспериментальных условий с использованием двух концентраций Раундапа (0 и 25 мкг/л), трех значений температуры (0, 10 и 20 ºС) и трех значений рН (5,0, 7,4 и 8,3). При оценке влияния гербицида гомогенаты предварительно выдерживали в присутствии Раундапа (произведен и расфасован ЗАО «Август», Россия) в течение 1 часа при соответствующих значениях температуры и рН. Концентрация Раундапа 25 мкг/л (рассчитанная по глифосату) выбрана в качестве действующей на гликозидазы рыб и беспозвоночных [13], и она в 100 раз ниже значений ЛК50 для этих гидробионтов [7, 9]. Выбор диапазона температуры обусловлен ее средними сезонными значениями для водоёмов умеренных широт России (0-3 °С зимой, 10 °С – весной и осенью, 20 °С – летом), а выбор рН – диапазоном изменений показателя в пищеварительном тракте рыб [15]. Ферментативную активность в каждой точке определяли в пяти повторностях с учетом фона (содержания глюкозы в исходном гомогенате) и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 мин инкубации ферментативно-активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/(г × мин)). Полученные результаты представлены в виде средних и их ошибок. Достоверность различий оценивали с помощью одно- и многофакторного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p = 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Максимальный уровень амилолитической активности у всех исследованных видов рыб выявлен при температуре 20 ºС и рН 7,4 в отсутствие Раундапа (табл. 1). Таблица 1 Влияние Раундапа на амилолитическую активность слизистой оболочки кишечника молоди рыб Температура, °СКонцентрация Раундапа, мкг/лАмилолитическая активность, мкмоль/(г · мин) Значения рН 5,07,48,3 Окунь 000,70 ± 0,010,69 ± 0,020,61 ± 0,01 250,61 ± 0,03*0,81 ± 0,050,59 ± 0,01 1001,11 ± 0,021,27 ± 0,030,94 ± 0,03 251,06 ± 0,031,26 ± 0,020,90 ± 0,02 2002,17 ± 0,052,18 ± 0,121,44 ± 0,03 252,07 ± 0,022,20 ± 0,061,47 ± 0,02 Тюлька 000,50 ± 0,000,92 ± 0,050,38 ± 0,08 250,10 ± 0,00*0,82 ± 0,130,10 ± 0,00* 1002,28 ± 0,043,00 ± 0,051,94 ± 0,07 251,80 ± 0,13*2,64 ± 0,07*1,30 ± 0,08* 2004,00 ± 0,064,60 ± 0,193,42 ± 0,13 253,06 ± 0,20*3,40 ± 0,14*3,10 ± 0,11 Продолжение табл. 1 Температура, °СКонцентрация Раундапа, мкг/лАмилолитическая активность, мкмоль/(г · мин) Значения рН 5,07,48,3 Карп 0011,0 ± 2,2224,2 ± 2,9420,1 ± 2,74 256,40 ± 0,46*27,4 ± 2,9812,3 ± 3,03* 10011,0 ± 1,8349,4 ± 2,2150,7 ± 5,18 256,86 ± 0,72*54,9 ± 2,4053,5 ± 1,71 20013,7 ± 3,31117,0 ± 2,33113,0 ± 1,71 259,60 ± 1,68*93,3 ± 3,10*113,0 ± 4,43 * Различия показателей в присутствии и в отсутствие Раундапа статистически достоверны при одних и тех же значениях температуры и рН, р < 0,05. При этих значениях температуры и рН Раундап снижает ферментативную активность у карпа на 20 %, у тюльки – на 26 % от контроля, у окуня изменения отсутствуют. В зоне кислых pH тормозящий эффект Раундапа у тюльки и карпа увеличивается в 1,5–3 раза, особенно при низкой температуре. Так, при температуре 0 ºС и pH 5,0 амилолитическая активность снижается на 14 % у окуня, на 42 % у карпа и на 80 % у тюльки по сравнению с таковой в отсутствие Раундапа. В зоне щелочных рН у окуня достоверных эффектов не выявлено, в то время как у карпа и тюльки тормозящий эффект Раундапа при температуре 0 ºС составил 39 и 74 % от контроля соответственно. Таким образом, однофакторный анализ выявил усиление эффектов Раундапа при изменении рН и снижении температуры инкубационной среды, в большей степени у тюльки, в меньшей – у окуня. Применение полифакторного анализа показало наибольшее снижение амилолитической активности при комплексном действии температуры 0 ºС, pH 5,0 и Раундапа: у окуня на 72 %, у карпа на 95 %, у тюльки на 98 % от таковой при температуре 20 ºС, рН 7,4 в отсутствие Раундапа. При этом если у окуня эффект обусловлен в основном совместным действием температуры и pH, то у тюльки и карпа статистически достоверное усиление эффекта отмечено при действии всех трех факторов (p < 0,0001). Максимальный уровень амилолитической активности в организме беспозвоночных выявлен при температуре 20 ºС и рН 7,4 в отсутствие Раундапа (табл. 2). В этих условиях тормозящий эффект Раундапа на амилолитическую активность у зоопланктона и дрейссены составил 7–8 % и был статистически недостоверен (р > 0,05). Таблица 2 Влияние Раундапа на амилолитическую активность в организме беспозвоночных Температура, °СКонцентрация Раундапа, мкг/лАмилолитическая активность, мкмоль/(г · мин) Значения рН 5,07,48,3 Зоопланктон 000,29 ± 0,040,45 ± 0,020,52 ± 0,03 250,26 ± 0,010,53 ± 0,030,52 ± 0,02 1000,77 ± 0,041,29 ± 0,021,32 ± 0,01 250,61 ± 0,04*1,36 ± 0,031,33 ± 0,02 2001,14 ± 0,022,15 ± 0,171,89 ± 0,05 250,96 ± 0,03*1,99 ± 0,051,97 ± 0,03 Хирономиды 003,74 ± 0,144,27 ± 0,133,52 ± 0,13 254,00 ± 0,114,32 ± 0,153,76 ± 0,07 1004,27 ± 0,114,27 ± 0,064,11 ± 0,11 253,54 ± 0,06*4,46 ± 0,243,79 ± 0,14 2004,18 ± 0,095,60 ± 0,174,78 ± 0,07 253,81 ± 0,136,00 ± 0,254,96 ± 0,18 Дрейссена 001,00 ± 0,061,09 ± 0,060,69 ± 0,05 251,03 ± 0,031,04 ± 0,050,85 ± 0,05 1001,07 ± 0,041,32 ± 0,020,80 ± 0,04 251,07 ± 0,061,23 ± 0,050,79 ± 0,03 2001,49 ± 0,081,99 ± 0,080,96 ± 0,03 251,38 ± 0,051,84 ± 0,051,09 ± 0,05 * Различия показателей в присутствии и в отсутствие Раундапа статистически достоверны при одних и тех же значениях температуры и рН, р < 0,05. При смещении pH в кислую сторону тормозящий эффект Раундапа у зоопланктона усиливается в 2-3 раза и составляет 16 и 21 % от контроля при температуре 20 и 10 ºС соответственно. Торможение амилолитической активности на 17 % у хирономид в присутствии Раундапа отмечено лишь при температуре 10 ºС и рН 5,0, у дрейссены достоверные эффекты отсутствуют. В зоне щелочных значений рН эффекты гербицида не выявлены. При комплексном действии трёх факторов наибольшее снижение амилолитической активности на 29 % у хирономид, на 65 % у дрейссены и на 88 % у зоопланктона отмечено при температуре 0 °С, рН 5,0 и в присутствии Раундапа по сравнению с максимальным уровнем, отмеченным при температуре 20 °С, рН 7,4 в отсутствие гербицида. Однако в значительной мере эти эффекты обусловлены лишь совместным действием низкой температуры и pH (p < 0,0001). Несмотря на то, что в последнее время токсическое влияние глифосата на рыб и беспозвоночных исследуется довольно интенсивно, биохимические механизмы его действия до сих пор не выяснены. Усиление тормозящего действия Раундапа на активность гликозидаз в зоне низких значений рН хорошо согласуется с представлениями о том, что токсичность глифосата вызвана главным образом его высокой кислотностью [5]. Несмотря на то, что токсический эффект Раундапа часто связывают с действием глифосата, установлено, что добавляемый в состав гербицида инертный компонент полиоксиэтиленамин может быть гораздо более токсичным, чем активный ингредиент [3, 5]. При этом результаты тестов с Hydra attenuate Pallas показали, что соотношение токсичности активного и вспомогательного компонентов может меняться в зависимости от концентрации гербицида [16]. Поскольку углеводы играют важную роль в энергетическом и пластическом обмене организма, а гидролазы жертвы могут принимать участие в пищеварении у рыб и обеспечивать аутодеградацию собственных тканей, изучение характеристик указанных ферментов при действии Раундапа представляет значительный интерес не только для экологической физиологии, но и для практики рыбного хозяйства. Результаты экспериментов in vitro позволяют не только расширить представления о токсичности этого гербицида в диапазоне значений температуры и рН, характерных для водоемов средней полосы России и пищеварительного тракта рыб, но и выявить негативные эффекты до появления видимых отклонений от нормы. Заключение Полученные результаты свидетельствуют о разной устойчивости гликозидаз, гидролизующих полисахариды в слизистой оболочке кишечника молоди рыб и в организме беспозвоночных, входящих в состав их кормовой базы, к in vitro действию Раундапа (25 мкг/л) в диапазоне значений температуры 0–20 ºС и рН 5,0–8,3. Максимальное торможение амилолитической активности в присутствии Раундапа показано при кислых значениях рН в кишечнике тюльки и карпа, в меньшей степени – у зоопланктона и хирономид. Снижение температуры при кислых рН усиливает тормозящий эффект Раундапа у зоопланктона и молоди исследованных видов рыб, при щелочных рН – лишь у тюльки и карпа. Гликозидазы окуня и дрейссены наиболее устойчивы к действию гербицида. Совместное действие температуры 0°С, кислых pH и Раундапа снижает амилолитическую активность в слизистой оболочке кишечника молоди рыб на 72–98 %, у беспозвоночных животных – лишь на 29–88 %. При этом у беспозвоночных тормозящий эффект при действии 3-х факторов в основном обусловлен совместным действием температуры и рН, а у питающейся ими молоди рыб вклад Раундапа в совместный эффект статистически значим.
