Москва, г. Москва и Московская область, Россия
аспирант
, Россия
УДК 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
ГРНТИ 68.41 Ветеринария
Цель исследований – морфологическое обоснование эффективности применения клеточных продуктов при разрыве ахиллова сухожилия. Среди клеточных препаратов наибольшей биологической безопасностью отличаются аутологичные. Из них в клинической практике положительно зарекомен-довали себя клетки стромально-васкулярной фракции и мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки, обладающие способностью к самоподдержанию, дифференцировке в различные клеточные ти-пы и мобилизующие в тканях репаративный процесс. Практически отсутствуют сведения о динамиче-ском морфологическом контроле процесса репарации при их применении Оценено влияние стромально-васкулярной фракции из жировой ткани крыс на регенеративные процессы при заживлении дефекта, выражающееся в снижении риска возникновения рецидивов, упорядоченной архитектонике волокон плотной оформленной соединительной ткани и активации формирования и созревания грануляцион-ной ткани. На основании данных о положительном влиянии исследуемого клеточного продукта на реге-нерацию ахиллова сухожилия научно обоснована целесообразность его применения в ветеринарной ме-дицине. Экспериментальная модель исследования – декоративная крыса (n=20). Материал для исследо-вания – ахиллово сухожилие. Использовали комплекс методов, включающих анатомическое препариро-вание, экспериментальное моделирование, гистологическое исследование биоптатов ахиллова сухожи-лия. Выявлено, что у подопытных животных, которым вводили данный клеточный продукт, обнаружены микроморфологические преобразования соединительной ткани, направленные на упорядоченность фиброархитектоники и утолщения пучков коллагеновых волокон. Стимулирующее влияние стромаль-но-васкулярной фракции на репаративные процессы дефекта ахиллова сухожилия выражается в боль-шей степени васкуляризации ткани и увеличении количества фибробластов у групп подопытных жи-вотных, в то время как у животных контрольной группы упорядоченность волокон нарушена, что спо-собствует возникновению рецидивов.
фракция, регенерация, повреждение, сухожилие, преобразование, продукт, суспензия
Одним из направлений в регенеративной медицине является использование аутологичных клеточных продуктов, действие которых направлено на оптимизацию регенераторного процесса в зоне повреждения [1, 5, 7].
Среди клеточных препаратов наибольшей биологической безопасностью отличаются аутологичные. Из них в клинической практике положительно зарекомендовали себя клетки стромально-васкулярной фракции (СВФ) и мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), обладающие способностью к самоподдержанию, дифференцировке в различные клеточные типы и мобилизующие в тканях репаративный процесс. Однако для внедрения клеточной терапии в ветеринарную практику требуется научное обоснование, основанное на комплексных экспериментальных исследованиях, являющихся базовыми для оценки возможностей применения аутологичных клеточных продуктов для восстановления анатомической целостности органов, поддержания структурного гомеостаза, профилактики рубцовых изменений в травмированной зоне, а также конкретизации показаний к применению и разработки схем лечения [3, 5, 6, 7].
Вместе с тем, практически отсутствуют сведения о динамическом морфологическом контроле процесса репарации при их применении [2, 4].
Цель исследований – морфологическое обоснование эффективности применения клеточных продуктов при разрыве ахиллова сухожилия.
Задачи исследований: 1) установить особенности анатомической организации ахиллова сухожилия у крыс; 2) представить морфологическую характеристику спонтанного заживления индуцированного повреждения сухожильной ткани; 3) охарактеризовать микроморфологическое состояние регенерата ахиллова сухожилия подопытной группы в динамике восстановительного процесса (на 7, 14, 30 и 60 сутки) под влиянием СВФ.
Материал и методы исследования. Исследования выполнены на базе кафедры анатомии и гистологии животных имени профессора А. Ф. Климова ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К. И. Скрябина и ООО «Центр ветеринарной клеточной медицины» на двух группах декоративных крыс разновидности «Стандарт» (контрольной и подопытной), подобранных по принципу аналогов.
Экспериментальные группы были сформированы из клинически здоровых животных с учетом происхождения, пола (самцы), возраста, живой массы. Животных карантинировали в течение
14 суток, проводили общеклиническое исследование. Использовали комплекс методов, включающих анатомическое препарирование, экспериментальное моделирование, гистологическое исследование биоптатов ахиллова сухожилия. В контрольной группе область повреждения заживала естественным путем, а в подопытной группе – под влиянием аутологичных клеток стромально-васкулярной фракции. Травму моделировали посредством поперечного разреза дистальной трети ахиллова сухожилия, ближе к месту прикрепления к пяточной кости заплюсны. В условиях полного расслабления мышц область повреждения сухожилия сшивали специальным швом.
Животным подопытной группы стромально-васкулярную фракцию вводили однократно в объеме 1 мл подкожно в область дефекта на расстоянии 5 мм от области травмы с двух сторон. У крыс контрольной группы область повреждения регенерировала самопроизвольно.
Проводили динамическое наблюдение за животными до момента выведения из эксперимента, которое осуществляли на 7, 14, 30 и 60 сутки путем эвтаназии в соответствии с требованиями этического комитета. Все манипуляции с лабораторными животными проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или иных научных целей» (Страсбург, 18 марта 1986 г. ETS №123) после выдерживания двухнедельного карантина. Для гистологических исследований образцы фиксировали в 10% нейтральном формалине. После фиксации образцы промывали водопроводной водой (24 часа), обезвоживали в спиртах возрастающей крепости (от 50% до 100%) и заливали в парафин-воск.
Серийные парафиновые срезы толщиной 5-10 мкм изготавливали на универсальном автоматизированном микротоме «HM-360» (Mikron, Германия).
Изучение общей морфологической картины проводили при помощи светового микроскопа «Nikon» (Япония) после окраски гистологических срезов гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону по общепринятым методикам.
Результаты исследований. На основании данных анатомического препарирования установлено, что в формировании ахиллова сухожилия у крыс участвуют: пяточные ветви двуглавой и полусухожильной мышцы, латеральная и медиальная икроножные мышцы и поверхностный сгибатель пальцев (рис. 1-4).
|
|
|
|
Рис. 1. Макроморфология пяточных ветвей двуглавой мышцы, участвующих
|
Рис. 2. Макроморфология пяточных ветвей полусухожильной мышцы, участвующей
|
|
|
|
|
Рис. 3. Макроморфология латеральной |
Рис. 4. Макроморфология поверхностного сгибателя пальцев, участвующего |
На основании результатов микроморфологического исследования регенерата ахиллова сухожилия животных установлено, что у животных подопытной группы на 7 сутки пучки коллагеновых волокон в зоне дефекта характеризуются упорядоченной ориентацией, в то время как у животных в группе контроля они разнонаправлены. Это может свидетельствовать о стимуляции регенеративных процессов в области индуцированного повреждения при введении стромально-васкулярной фракции (рис. 5).
|
|
|
|
а |
б |
|
Рис. 5. Микроморфологическая картина регенерата сухожилия на 7 сутки |
|
При сравнительном анализе регенерата сухожилия на 14 сутки было установлено, что у животных подопытной группы, которым вводили аутологичный клеточный продукт, четко выражено взаимно параллельное расположение коллагеновых волокон с видимыми границами дифференциации на пучки первого и второго порядков. Более того, волокна приобретают волнистый ход, что может свидетельствовать о наличии у них резерва длины при натяжении. У крыс в контрольной группе на 14 сутки наблюдений пучки волокон сохраняют разнонаправленную организацию, что может свидетельствовать о риске возможных рецидивов. Кроме того, микроморфологическая картина сухожилия в подопытной группе характеризуется увеличением, по сравнению с контролем, клеток соединительной ткани, а также толщины пучков коллагеновых волокон. Все это отражает стимулирующее влияние аутологичной суспензии клеток СВФ на репарацию ткани сухожилия (рис. 6).
|
|
|
|
а |
б |
|
Рис. 6. Микроморфологическая характеристика регенерата сухожилия на 14 сутки
|
|
На 30 сутки регенеративные процессы в зоне дефекта были направлены на улучшение васкуляризации клеточных структур регенерата и увеличение количества фибробластов в подопытной группе по сравнению с группой контроля, в которой только происходит формирование пучков волокон. Под действием стромально-васкулярной фракции активнее протекает формирование и созревание грануляционной ткани. Фиброзная ткань замещает область дефекта вследствие действия суспензии (рис. 7).
|
|
|
|
а |
б |
|
Рис. 7. Микроморфологическая характеристика. Структурная организация регенерата сухожилия
|
|
Представленные данные свидетельствуют, что на финальном этапе эксперимента (60 сутки) в подопытной группе, в сравнении с контрольной группой, произошло полное заживление дефекта сухожилия. Важнейшим критерием, отражающим полное восстановление травмированного сухожилия, является упорядоченность фиброархитектоники, взаимно параллельное расположение волокон и утолщение их пучков. Кроме того, подопытным образцам присуща большая, по сравнению с регенератом, образующемся при самопроизвольном заживлении, степень их васкуляризаци. В контрольной группе, даже на 60 сутки наблюдения, вновь образованная соединительная ткань не имеет четкого структурного оформления, что может являться фактором риска возникновения рецидивов повреждения (микронадрывов ткани) (рис. 8).
|
|
|
|
а |
б |
|
Рис. 8. Микроморфологическая характеристика регенерата сухожилия на 60 сутки |
|
Заключение. На основании проведенных исследований установлено: 1) в структурном оформлении ахиллова сухожилия крыс участвуют: пяточные ветви двуглавой и полусухожильной мышцы, латеральная и медиальная икроножные мышцы и поверхностный сгибатель пальцев;
2) у подопытных животных обнаружены микроморфологические преобразования соединительной ткани, направленные на упорядоченность фиброархитектоники и утолщение пучков коллагеновых волокон, в то время как у животных контрольной группы – нарушения упорядоченности волокон, что способствует возникновению рецидивов; 3) микроморфологические показатели свидетельствуют о положительном результате экспериментальной апробации применения аутологичной суспензии клеток СВФ при лечении животных с разрывом сухожилий.
1. Деев, Р. В. Профессор Александр Александрович Максимов: эволюция идей // Гены & клетки. – 2014. – Т. IX, № 2. – С. 2-14.
2. Дыгай, А. М. Клеточная терапия: новые подходы / А. М. Дыгай, Г. Н. Зюзьков // Наука в России. – 2009. – Т. 169, №1. – С. 4-8.
3. Елисеев, В. Г. Атлас микроскопического и ультрамикроскопического строения клеток, тканей и органов / В. Г. Елисеев, Ю. И. Афанасьев, Е. Ф. Котовский, А. Н. Яцковский. – 5-е изд., перераб. и доп. – М. : Медицина, 2004. – С. 99-104.
4. Калиновский, А. А. Актуальные проблемы применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в современной ветеринарной медицине // Ветеринария Кубани. – 2011. – № 3. – С. 28-31.
5. Лопатина, Т. В. Индукции нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани / Т. В. Ло-патина, Н. И. Калинина, А. В. Ревищин [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2008. – Т. IV, №3. – С. 50-54.
6. Пальцев, М. А. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Т. 1. Что есть стволовая клетка? / М. А. Пальцев, В. В. Терских, А. В. Васильев. – М. : Медицина ; Шико, 2009. – С. 13-31.
7. Семченко В. В. Регенеративная биология и медицина. Книга I. Генные технологии и клонированиe / В. В. Семченко, С. И. Ерениев, С. С. Степанов [и др.]. – Омск-Москва-Томск : Омская областная типография, 2012. – 296 с.
