Кемерово, Кемеровская область, Россия
Кемерово, Кемеровская область, Россия
Кемерово, Кемеровская область, Россия
Введение. Эволюционируя, патогенные микроорганизмы включают новые механизмы защиты против антибиотиков, вынуждая вести поиск новых антимикробных средств. Формы на основе комплексов, по сравнению со свободными лигандами, проявляют синергетический антимикробный эффект. Рассмотрены современные направления по созданию антимикробных систем. Цель работы – скрининг антимикробных свойств нитритных комплексов платины. Объекты и методы исследования. Антимикробную активность оценивали для пяти синтезированных комплексов платины (II) и платины (IV), моноядерных и биядерных, содержащих концевые и мостиковые нитритные лиганды, в отношении тест-культур Bacillus subtilis и Aspergillus niger с использованием диск-диффузионного метода и макрометода серийных разведений. Результаты и их обсуждение. Все исследуемые комплексы обладают способностью ингибировать метаболический рост микроорганизмов в разной степени, зависящей от состава, строения, термодинамической устойчивости комплекса, числа и заряда координационных центров, степени окисления платины. Более выраженная активность проявилась против Aspergillus niger. Комплекс-неэлектролит Pt+2, содержащий концевые и мостиковые NO2–-лиганды, проявляет меньшую активность, чем катионный комплекс Pt+2, содержащий только мостиковые NO2–-лиганды. Самой высокой антибактериальной активностью обладает биядерный комплекс PtIV-PtII [(NH3)2 (NO2)2PtIV(µ-NO2)2PtII(NH3)2](NO3)2. МИК составила > 125 мкм. Выводы. Полиядерные комплексы содержат два или более платиновых центра, способны ковалентно связываться с ДНК, образовывать совершенно иной вид аддуктов ДНК, по сравнению с моноядерными комплексами, формировать сшивки между цепями с фиксацией на различных участках. Октаэдрические комплексы платины, по сравнению с плоскоквадратными, способны действовать как пролекарства, восстанавливаясь внутри или вне бактериальной клетки. Дальнейшие исследования будут нацелены на композиционные смеси комплексов с известными антимикробными агентами, и в отношении других штаммов бактерий.
Антимикробная активность, платина, лиганды, Bacillus subtilis, Aspergillus niger
Введение Во время бушующей эпидемии остро встает вопрос быстрого поиска высокоэффективных антибактериальных препаратов. Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы высоко адаптированы к изменению внешних условий и быстро приобретают резистентность к антибиотикам, антисептикам, дезинфектантам и прочим противомикробным препаратам. Это ведет к непредсказуемости исходов осложнений у человека и живых организмов при лечении и профилактике заболеваний. Антибактериальные вещества, противовоспали- тельные терапевтические агенты, противовирусные препараты, антибиотики, антисептики, антиокси- данты, бактериофаги, консерванты, дезинфектанты – без них невозможно представить жизнь человека. Колоссальное количество исследований посвящено этой теме. По дескрипторам Antimicrobial activity за последние пять лет в БД Scopus найдено 73 тыс научных статей, из которых 10 тыс – обзорные
статьи, а 3 тыс посвящены исследованию антимикробной активность комплексов платины. Следует отметить несколько современных и перспективных направлений, на которые нацелено внимание исследователей всего мира. Аналитический обзор Использование природных стратегий нерибо- сомального синтеза пептидов. Из различных морских микроорганизмов выделены десятки метаболитов, являющихся полипептидами, которые используют для конкурентной меж- и внутривидовой борьбы экосистем [1]. Изучение типов и структур первичных и вторичных метаболитов, а также механизмов их антибактериального действия выявило огромный потенциал их применения в качестве природных консервантов продуктов, медицинских и ветеринарных терапевтических препаратов или фитосанитарных средств для защиты растений [2]. Следует иметь в виду, что некоторые бактерии (например, Clostridium botulinum, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Yersinia sp.) синтезируют экзотоксины, являющиеся вторичными метаболитами и вызывающие заболевания у человека [3]. Создание аналогов природных защитных молекул, обеспечивающих противостояние макроорганизма патогенным бактериям, т. е. аналогов антимикробных пептидов системы врожденного иммунитета [4]. Бактериоцины, обладающие антимикробными свойствами, за счет широкого спектра антагонистической активности могут представлять альтернативу антибиотикам [5]. Механизмы действия бактериоцинов против бактериальных клеток разнообразны. Один из механизмов – это образование каналов в цитоплазматической мембране, что нарушает мембранный потенциал клетки и все биохимические процессы. Бактериоцины вызывают нуклеазную деградацию нуклеиновых кислот клетки, а также, помимо разрушения клеточной ДНК, вызывают полное ингибирование липидного синтеза бактерий. Другой механизм связан с нарушением белкового синтеза клетки, что происходит за счет специфического расщепления рибосомальной 16S РНК, нарушение синтеза тРНК и клеточных ферментов. Антибактериальные свойства проявляют штаммы микроорганизмов, выделенных из различного растительного и животного сырья. Известно об антибактериальной активности штаммов Bacillus safensis, Bacillus endopheticus, Bacillus subtilis [6].
В работе [7] изучен антимикробный потенциал бактериоцинов молочнокислых бактерий штаммов Lactobacillus в отношении некоторых штаммов патогенных микроорганизмов. Антимикробные пептиды энтерококков – бактериоцины – являются важной группой защитных факторов, с помощью которых бактерии данного рода обеспечивают колонизационную резистентность биотопов пищеварительного тракта [8]. Методом твердофазной экстракции выде- лены бактериоцины (пептидные фракции массой
1,0–3,0 кДа) из метаболитов Enterococcus faecium. Механизм биологического действия пептидов оценивали с использованием ДНК-тропных красителей с последующей регистрацией спектров флуоресценции. Бактерицидное действие энтеро- цинов направлено на цитоплазматическую мембрану клеток-мишеней с формированием в ней пор, что ведет к выходу внутриклеточного калия, аминокислот и других низкомолекулярных веществ [9]. Анти-биопленочные антимикробные агенты. Новое поколение антимикробных агентов действует как профилактический или терапевтический инструмент для контроля синтеза биопленки, устойчивой к антибиотикам, включая биопленки, образуемые микробами на поверхностях различных медицинских устройств. Свойство мембранной проницаемости агентов делает их эффективными в быстром уничтожении бактерий с множественной лекарственной устойчивостью [10]. Также действуют как против спящих, так и против растущих клеток, независимо от их метаболического состояния. Кроме того, их заряд способствует взаимодействию с отрицательно заряженными бактериальными поверхностями, мешая метаболическим процессам или внутриклеточным мишеням. Это может привести к ингибированию синтеза клеточной стенки, синтеза нуклеиновых кислот и продуцирования белка. В медицине патогенный эффект микроорга- низма S. aureus объясняется различными факторами вирулентности, такими как адгезия к клеткам, продуцирование токсинов, ферментов и хемотаксических факторов. Кроме того,
S. aureus создает биопленки на поверхностях катетеров и имплантированных медицинских устройств (шунты для жидкости, протезы суставов и кардиостимуляторы), в результате чего микроорганизм становится устойчивым к антибиотикам и врожденной защите хозяина [11]. Анти-биопленочные агенты особенно ценны в плане профилактики образования микробных пленок,
Рисунок 1. Результаты окрашивания колоний штаммов золотистого стафилококка [12]: образующие черные колонии – штаммы-продуценты биопленки; образующие красные колонии – штаммы, не продуцирующие биопленку Figure 1. Staining of Staphylococcus aureus [12]: black colonies are biofilm producing strains; red colonies are strains that do not produce biofilm
Колонии на конго-рот-агаре (штамм, синтезирующий слизь)Штаммы МРЗС Темный Темный Темный Красный Красный Красный Темный
Красные колонии (штамм МРЗС, не производящий слизь)
Темные колонии (штамм МРЗС, производящий слизь)
332
Salishcheva O.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 2, pp. 329–342
т. к. убивают планктонные клетки, способные создавать биопленку, подавляют рост клеток, уже присутствовавших в биопленке, и блокируют адгезию к поверхности.
В статье E. Ciandrini и др. изучен синергетический эффект против биопленок золо- тистого стафилококка (МRSА) для оценки способности антимикробных пептидов ингибировать образование биопленки (рис. 1) [12]. Исследованы пептиды: Темпорин А, Ситропин 1.1, Гибридный пептид цекропина A-мелиттина [CA (1-7) M (2-9)
NH2], Pal-KGK-NH2 (с последовательностью пальмитоил-лиз-гли-лиз-NH2). Для оценки спо- собности продуцировать «слизь» колонии каждого штамма (MRSA) высевали на поверхность чашек с агаром и красителем. Штаммы-продуценты биопленки были идентифицированы как штаммы, образующие черные колонии, а штаммы, не продуцирующие биопленку, как штаммы с красными колониями. Учитывая, что бактерии в биопленках встроены во внеклеточную матрицу, состоящую из смеси полимерных веществ, комбинация антимикробных пептидов с ферментами, ингиби- торами, хелатирующими агентами и дезагреги- рующими матрицу агентами приводит к усилению анти-биопленочной активности. Помимо антибиопленочной активности, антимикробные пептиды имеют ряд преимуществ: эффективность мембранного нацеливания, быстрота бактерицидного действия, низкая иммуногенность, низкие цито- токсичность и риск резистентности [11]. В пищевой промышленности всегда актуально создание антимикробных упаковочных материалов, включая бионанокомпозиции для предотвращения
Рисунок 2. Изображения электронного сканирующего микроскопа тестовых-культур S. aureus (A), E. coli (B), C. albicans (C) после инкубации с физиологическим раствором; тестовых-культур S. aureus (D), E. coli (E), C. albicans (F) c оксидом графена (29 мг/мл) выдержка в течение 2 ч и 24 ч; (G), (H), (I) соответственно [14] Figure 2. Electronic scanning microscope images: test cultures of S. aureus (A), E. coli (B), C. albicans (C) after incubation with saline; test cultures of S. aureus (D), E. coli (E), C. albicans (F) with graphene oxide (29 mg/mL) exposure for 2 h and 24 h; (G), (H), (I), respectively [14]
Рисунок 3. Потенциальные механизмы антимикробной активности наночастиц [17] Figure 3. Potential mechanisms of the antimicrobial activity of nanoparticles [17]
Грамотрицательные бактерии Липополисахарид
Стенка клетки
Порины
Мембранный белок
Наночастицы (НЧ)
Грамположительные бактерии Липотейхоевая кислота
Пептидогликан
Клеточная мембрана
Взаимодействие НЧ с биологически направленными макромолекулами на поверхности клеток Распределение клеток
Производство активных форм кислорода (АФК) Клетка высвобождает ионы из НЧ Распределение ферментной активности
Фермент
Взаимодействие НЧ с ДНК бактерий
Бактериальная клетка Физическое взаимодействие между НЧ и стенкой клетки
Денатурация липидов и белка
А В
D
C
E F
G H I
0
10
20
30
40
0 200 400 600 800 1000
Светорассеяние , %
Концентрация комплекса, мкм В4647 Aspergillus niger
333
Салищева О. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 2 С. 329–342 распространения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах [13]. Наносистемы. Большое внимание уделяется изучению наноструктур. Ранее проведенные исследования в области антимикробных свойств оксида графена привели к объяснению механизма его антимикробного действия за счет влияния двух факторов: механического повреждения мембраны микробных клеток острыми концами нанотрубок оксида графена и запуском окислительного стрес- са [14]. Максимальное противомикробное влияние проявляется через 2 часа взаимодействия с суспензией оксида графена. Под ее воздействием происходит повреждение клеточной мембраны микроорганизма с последующей его гибелью. Чувствительность к оксиду графена обнаружена у бактерий и грибов. При этом грамположительные толстостенные бактерии погибают под действием наночастиц быстрее, чем грамотрицательные тонкостенные. Изображения, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа (рис. 2), показывают, что клетки тест-культур покрываются слоем нанолистов, что ограничивает жизнедеятельность. Дальнейший контакт микроорганизмов с наночастицами приводит к нарушению целостности клеточной мембраны с вытеканием внутреннего содержимого, приводящий к гибели клетки. Исследование бактерицидных свойств наночастиц ZnO, TiO2 и SiO2 по отношению к микроорганизмам Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aureobasidium pullulans, Cladosporium cladospo- rioides, Penicillium ochrochloron, Trichoderma viride, Paecilomyces variotii открывает перспективы в использовании наноматериалов для изготовления защитных покрытий, устойчивых к биоповрежде- нию [15]. Водорастворимые нанокомпозиты элементарно- го селена, синтезированные окислением поли- функционального органического соединения селена с использованием природного полисахарида арабиногалактана в качестве стабилизатора нано- частиц, формируются в виде диспергированных в полисахаридной матрице сферических частиц аморфного селена размером 31–78 нм. Для нанокомпозита, содержащего 3,9 % Se, установлена выраженная антимикробная активность в отношении бактериального фитопатогена Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus [16]. В большинстве случаев наночастицы металлов служат «системой доставки» нужного препарата. На рисунке 3 представлены механизмы антибактериального действия наночастиц [17]. Одним из наиболее распространенных является адсорбционный механизм. При адсорбции наночастиц на поверхности клеточной мембраны нарушаются ее проницаемость и дыхательные функции. Другой механизм рассматривает способность наночастиц проникать внутрь клетки, взаимодействовать с фосфор- и серосодержащими веществами, нарушая окисления и фосфорилирования. Кроме того, наночастицы внутри клетки способствуют образованию свободных радикалов или активных форм кислорода. Антимикробные поверхностно-активные ве- щества. В исследовании T. P. Pirog и др. представлен анализ данных литературы последних лет относительно антибактериальнойи антифунгицидной активности микробных поверхностно-активных веществ (ПАВ): липопептидов, синтезированных представителями родов Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Brevibacillus; рамнолипидов бактерий родов Pseudomonas, Burkholderia, Lysinibacillus; софоролипидов дрожжей родов Candida (Starmerella и Rhodotorula), а также собственных экспериментальных исследований антимикробной активности ПАВ, синтезированных Acinetobacter calcoaceticus ІМВВ-7241, Rhodococcus erythropolis ІМВAс-5017 и Nocardia vaccinii ІМВВ7405 [18]. Липопептиды являются эффективными антимикробными агентами по сравнению с гликолипидами. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) липопептидов, рамнолипидов и софоролипидов составляют (мкг/мл) 1–32, 50–500 и 10–200 соответственно. Преимуществами гликолипидов как антимикробных агентов, по сравнению с липопептидами, являются возможность их синтеза на промышленных отходах и высокая концентрация синтезированных ПАВ. Механизм антимикробной активности ПАВ связывают с адсорбцией ПАВ, образованием комплексов на поверхности микробной клетки, изменением электрохимических свойств и проницаемости мембраны и, как следствие, нарушением физиологических процессов и ферментативной активности микроорганизмов. Моно- и полиядерные комплексы платины. После открытия противораковой активности комплексов платины возросло число работ, посвященных исследованию цитотоксических и антимикробных свойств координационных соединений металлов платиновой группы. Введение биологически активных лигандов в координационные соединения металлов имеет большое значение для разработки новых лекарственных средств с улучшенной и целенаправленной активностью. Исследования таких комплексов показывают, что новые механизмы действия благоприятны при сочетании биоактивности лиганда со свойствами, присущими металлу. Это приводит к возможности преодоления существующих путей лекарственной устойчивости. Лиганды вводятся в систему для ограничения неблагоприятного воздействия избыточных ионов металлов. При хелатировании лигандов с ионом металла происходят некоторые
334
Salishcheva O.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 2, pp. 329–342 радикальные изменения, включающие повышенную липофильность, стабилизацию специфических окислительных состояний и способствующие инертности замещения. Лекарственные средства на основе комплексов металлов могут играть неотъемлемую роль в достижении нужной потенциальной антибактериальной активности и токсичности металлического препарата, применяемого для диагностики и терапии. По сравнению с высоко реакционноспособными нано- частицами комплексные соединения способны проявлять меньшую токсичность. Известно множество комплексов различных металлов в органических лиганданах природного происхождения. Например, водорастворимые металлокомплексы никеля и кобальта на основе пектината натрия, проявляющие антимикробную активность [19]. Многочисленные моно- и полиядерные комплексы платины были синтезированы в последние годы. Большое внимание было сосредоточено на полиядерных комплексах платины, которые вошли в фазу I клинических испытаний в 1998 году. Один из классов противоопухолевых полиядерных соединений платины представлен азолатомостиковыми динуклеарными комплексами платины, которые при дополнительном электростатическом взаимодействии образуют аддукты ДНК [20]. Синтезированы биядерные комплексы Pt (II) с фторированными гетероциклическими лигандами: 5-перфторалкил-1,2,4-оксадиазолилпиридином и 3-перфторалкил-1-метил-1,2,4-триазолилпиридином [20]. Роль мостиков между двумя атомами платины осуществляли атомы хлора. Комплексы проявили антимикробную активность в отношении кишечной палочки, Kocuriarhizophila и двух штаммов золотистого стафилококка. Известно большое число карбоксилатных элементорганических бетаинов на основе фосфора, серы, азота, кремния и пр. Все эти соединения используются широко в медицине в качестве лекарственных препаратов. Самый известный карбоксилатный бетаин – глицин – входит в состав белков и выполняет важную роль в биологических процессах. Арсенобетаин, выделенный из морепродуктов, синтезируется различными видами фотосинтезирующих организмов, включая водоросли, фитопланктон, цианобактерии [21]. На основе карбоновых кислот взаимодействием их галогенпроизводных 2-хлор и 2-бромуксусной, 3-хлор- и 3-бромпропановой кислот с диметилсульфоксидом синтезированы третичные сульфониевые соли. Аналогичные бетаины были выделены путем экстракции из листьев Spartinaanglica. Синтез карбоксилатных сульфабетаинов открывает широкие возможности для получения новых биологически активных веществ. Эти соединения проявляют селективную биологическую активность в отношении патогенной микрофлоры человека и животных Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Salmonellap. B. [21]. Для синтеза комплексов, проявляющих биологическую активность, в качестве лигандов широко используют биоорганические соединения с выраженной биологической функцией. Основания Шиффа и их комплексы, содержащие донорные атомы азота и кислорода, обладают антимикробной и противоопухолевой активностью [22]. Комплексы оснований Шиффа представлены в производстве соединений, представляющих фармацевтический интерес. Наличие электронодонорных и электроакцепторных заместителей оказывает влияние на комплексо- образование, а также на антимикробное и противоопухолевое поведение. Гетероциклические азотсодержащие соединения представлены в различных областях. Пиримидиновые кольца являются составляющей системой множества веществ, включая природные, которые играют жизненно важную роль в биологических процессах. Например, витамины, коферменты, пурины, птерины, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты. Свойства пиримидинов в значительной степени определяются электронно-акцепторными свойствами двух атомов азота. Каждый из них усиливает электронный эффект другого в 2-, 4- и 6-положениях. Производные пиримидинов используются в медицинской химии и
обладают выраженной антимикробной, противо- опухолевой и противогрибковой активностями [23]. Пиразолон является одним из важных гетероциклических соединений, имеющих пятичлен- ное кольцо и дополнительную группу кето (C=O). Производные пиразолона, обладающие превосходной способностью образовывать хелаты с рядом катионов металлов и реакционной способностью положения -4
в пиразоловом кольце, широко применяются как антимикробные и терапевтические агенты в составе металлокомплексов [24]. Производные кумарина представляют важную группу природных соединений из-за их ценной и разнообразной биологической активности. Химические модификации этих соединений привели к получению препаратов, используемых в клинической практике (антикоагулянты, антитромботические агенты). Азотсодержащие гетероциклические производные кумаринов обладают антиокси- дантной, противоопухолевой и антибактериальной активностью [25]. В работе А. Н. Евстропова с соавторами были исследованы антимикробные свойства синтезированных производных кумаринов на основе растительного фурокумарина пеуцеданина на тест-культурах Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, а также эффект торможения
335
Салищева О. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 2 С. 329–342 препаратами адгезивной активности Р. аeruginosa при моделировании пленкообразования на поверхности медицинских материалов [25]. Изучено комплексообразование платины (II) с различными серу-кислород и азот-кислород содержащими лигандами:этилендиаминдиацетатом и меркаптоуксусной кислотой [26]. При бидентатной координации этилендиаминдиацетата по атому азота карбоксильная группа лиганда не участвует в комплексообразовании. Комплексы образуют пятичленный металл-хелатный циклы. В зависимости от состава и строения комплексы проявляют различную антимикробную активность. Платиновые комплексы, содержащие полиами- новые лиганды, за счет атомов азота способны к образованию водородных связей с ДНК. Антимикробный и противоопухолевый эффекты комплексов платины достигаются за счет ингибирования синтеза ДНК, РНК и белков клеток, формирования сшивок между цепями ДНК и фиксацией одной ее цепи за счет преимущественного связывания с пуриновыми азотистыми основаниями. Либо соединение платины за счет одной валентности с ДНК, а другой – с амино- и гидроксигруппами молекулы белка [27]. Исследование биологической активности октаэдрических комплексов четырехвалентной платины, являющихся кинетически и термодинамически инертными соединениями, по сравнению с аналогичными плоскоквадратными комплексами двухвалентной платины, показало, что они действуют как пролекарства и восстанавливаются внутри или вне опухолевой клетки [28]. Отметим, что в последние два десятилетия большое число работ посвящено изучению противоопухолевых и антимикробных свойств октаэдрических комплексов платины, считавшихся ранее не применимыми для этих целей. Преимущество комплексов четырехвалентной платины перед комплексами двухвалентной платины заключается в их высокой активности и в более низкой токсичности. Взаимодействием гидрата гексахлороплатиново- дородной кислоты с хлоридами органиламмония в ацетонитриле получены комплексы [(C2H5)2
NH2]2[PtCl6], [(C2H5)4N]2[PtCl6] и [(CH3)3NH]2[PtCl6] [27]. Синтезированные кристаллы состоят из тетраэдрических катионов органиламмония и гексахлороплатинатных октаэдрических анионов. Изучена антимикробная активность синтезированных комплексов в отношении Escherichia coli штамма М-17. Антибактериальная активность была исследована при концентрациях комплексов 0,029, 0,0029 и 0,00029 моль/дм3. Нитрит-ион является амбидентатным лигандом и может координироваться за счет донорных атомов азота и кислорода, образуя с ионами переходных металлов многочисленные координационные соединения: нитрокомплексы за счет атомов азота; нитритокомплексы – монодентатно за счет атомов кислорода; хелатные комплексы – бидентатно за счет атомов кислорода; мостиковые – с одновременным присоединением к двум атомам металла. Нитрогруппа в комплексах платины координирована через азот. Высокая прочность и инертность связи платины с азотом практически исключает возможность изомеризации нитрогруппы в комплексах. Ранее был разработан метод направленного синтеза биядерных комплексов платины с различными мостиковыми лигандами с помощью которого синтезированы серии комплексных соединений платины и палладия. В них реализуются оба способа координации нитрогрупп, а именно биядерные комплексы, в которых NO2-группа связана с двумя центральными атомами одновременно через атомы азота и кислорода, т. е. является мостиком [29, 30]. Азотсодержащие комплексы признаны биологически активным соединениями за счет содержания нитрогруппы. Они проявляют большую
ДНК-связывающую и антимикробную активность, чем другие комплексы [23]. Комплексные соединения платины проявляют высокий антимикробный эффект, не уступая в активности известным современным антимикробным агентам. Кроме того, их относят к неклассическим алкилирующим препаратам, обладающим цитостатическим противоопухолевым действием. Механизм биологического действия комплексов металлов в биологических системах не до конца изучен, но особенности действия связаны с их способностью модифицировать метаболизм в клетках за счет стерического и электронного воздействия. Основная особенность – электронно-донорная природа биомолекул и электронно-акцепторная способность ионов платины. За счет этого наблюдается сильное химическое взаимодействие. Не следует исключать нековалентное взаимодействие комплексов платины с ДНК в режиме интеркаляции и электростатического взаимодействия. Изменяя структуру комплекса (состав и заряд внутренней сферы, число координационных центров, природу и дентатность лигандов и пр.), достигается высокая антибактериальная активность и низкий токсический эффект комплексов. Целью работы является исследование анти- микробных свойств синтезированных моноядерных и биядерных нитритных комплексов платины (II) и платины (IV) в отношении тест-культур Bacillus subtilis и Aspergillus niger. Объекты и методы исследования В качестве тест-культур использовали стандартные штаммы микроорганизмов Всерос- сийской коллекции ГосНИИ Генетика (Москва): Bacillus subtilis B-4647 и Aspergillus niger.
336
Salishcheva O.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 2, pp. 329–342 Исследование проводилось в НИИ биотехнологии Кемеровского государственного университета. Для каждого штамма готовили суспензию на основе дистиллированной воды с конечной концентрацией 108 КОЕ/мл. Микроорганизмы были культивированы на питательных средах, в соответствии с паспортом штамма, с последующей инокуляцией и инкубированием в средах. Для Bacillus subtilis B-4647 – мясопептонный агар (МПА), для Aspergillus niger – бульон Сабуро. Температура инкубирования – 37 °С, время инкубирования –
24–48 ч. Антимикробную активность оценивали для пяти комплексов платины (II) и платины (IV) моноядерных и биядерных, содержащих концевые и/или мости- ковые нитритные лиганды. Синтез описан в [29, 30].
[(NO2)2PtII(μ-NO2)2PtII(NH3)2] (I) [(NH3)2PtII(μ-NO2)2PtII(NH3)2](NO3)2 (II) [(NH3)2 (NO2)2PtIV(µ-NO2)2PtII(NH3)2](NO3)2 (III) [PtIV(NH3)2(NO2)2Cl2] (IV) [PtII(NH3)4]·[PtII(NO2)4] (V)
Для тестирования антимикробной активности использовали диск-диффузионный метод. На поверхность агаризованной среды вносили 0,5 мкл суспензии исследуемых микроорганизмов (~106 КОЕ), затем помещали бумажные диски, пропитанные водным раствором комплексного соединения
(с = 1×10–3 моль/дм3). После инкубирования при 37 °С
в течение 24 ч наблюдали зоны ингибирования. Эффект ингибирования сравнивали с эффектом антибактериального препарата хлорамфеникола.
Минимальную ингибирующую концентрацию (MИK) комплексов определяли макрометодом разве- дения в жидкой питательной среде мясопептонном бульоне (МПБ). Тестирование проводили в пробирках путем двукратного разведения МПБ, содержащего исследуемый комплекс. Начальная концентрация комплекса составляла 1×10–3 моль/дм3
(1000 мкм). Стандартную суспензию тестмикроорганизмов вносили во все пробирки
(~107 КОЕ/мл). Рост микроорганизмов контроли- ровали после инкубирования при 37 °С через 24 ч, измеряя светорассеяние при λ = 980 нм с помощью спектрофотометра UV 1800 (Shimadzu). МИК определяли как самую минимальную концентрацию комплекса, при которой происходит сдерживание видимого роста тест-культур.
Результаты и их обсуждение Антибактериальный скрининг комплексов показан на рисунке 4 (табл. 1). Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемые комплексные соединения обладают способностью ингибировать метаболический рост микроорганизмов в разной степени. Антимикробная активность зависит от состава и строения комплекса платины, числа координационных центров, их заряда, растворимости, от степени окисления центрального атома, термодинамической устойчивости и лабильности связей лигандов с комплексообразователем. Исследование процесса подавления роста бактерий и грибов через 24 ч показало, что зона ингибирования комплекса PtIV-PtII [(NH3)2 (NO2)2PtIV (µ-NO2)2PtII(NH3)2](NO3)2 сопоставима с зоной инги- бирования для антимикробного препарата, который
(а) (б) Рисунок 4. Антибактериальная активность нитритных комплексов платины: зоны ингибирования через 24 ч: (а) грибов Aspergillus niger; (б) бактерий Bacillus subtilis. Для сравнения приведены зоны ингибирования в отсутствии комплексов при действии антибактериального препарата (XX) и без него (X) Figure 4. Antibacterial activity of platinum nitrite complexes: inhibition zones after 24 h: (a) Aspergillus niger fungi; (b) Bacillus subtilis bacteria. For comparison: zones of inhibition without complexes, with and without antibacterial drug (XX) (X)
337
Салищева О. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 2 С. 329–342
А В
D
C
E F
G H I
0
10
20
30
40
0 200 400 600 800 1000
Светорассеяние , %
Концентрация комплекса, мкм В4647 Aspergillus niger
обладает самой высокой активностью по отношению к Bacillus subtilis В4647 и Aspergillus niger. Результаты скрининга показали, что более выраженная активность всех комплексов проявилась против грибов Aspergillus niger. Для биядерного комплекса Pt+2, содержащего концевые и мостиковые нитритные лиганды (комплекс I), диаметр зон ингибирования меньше, чем для комплекса Pt+2, содержащего только мостиковые нитритные лиганды (соединение II). Соединение двухвалентной платины с комплексными катионом и анионом (соединение V) проявляет избирательную активность. Самым высоким антибактериальным эффектом обладает биядерный комплекс PtIV-PtII [(NH3)2 (NO2)2PtIV(µ-NO2)2PtII(NH3)2](NO3)2 против Bacillus subtilis В4647 и Aspergillus niger. С одной стороны, повышение общего электрического заряда металлоцентров приводит к дополнительному электростатическому взаимодействию с образова- нием аддуктов с ДНК. С другой стороны, повышенная активность хелатов металлов может быть
объяснена на основе хелатной теории Твиди [31].
Согласно ей полярности лиганда и центрального атома металла уменьшаются посредством уравновешивания заряда по всему хелатному кольцу. Это повышает липофильный характер хелата металла и способствует его проникновению через липидный слой бактериальных мембран. Сравнивая активность биядерного и моноядерного комплексов Pt+4 (соединения III и IV), видно превышение антибактериальной активности для биядерного комплекса почти в два раза. Моноядерный комплекс Pt+4 содержит лабильные связи центрального атома с хлором, аналогично цисплатину. Однако исследование термодинамической устойчивости мономерных и димерных нитритных комплексов платины показали, что значения констант нестойкости kCl для комплекса Pt+4 на порядок ниже, чем для комплекса Pt+2 [32]. Ион NO2– за счет π-акцепторных свойств является не только транс-активным лигандом, но и сильным σ-донором, поэтому скорость замещения атома хлора по координате NO2-Pt-Cl уменьшается с повышением прочности связи Pt-Cl. Согласно данным [23] соединения за счет наличия высокоэлектронной нитрогруппы (-NO2) проявляют высокую биологическую активность. Присутствие нитрогруппы действует не только как химические изостеры для атомов кислорода в гетероциклическом основании тимидина, но и участвует в «сильной» O-H связи. В результате проявляется большая ДНК-связывающая и антимикробная активность в сравнении с другими комплексами. Минимальная (бактерицидная) ингибирующая концентрация (MИK) нитритных комплексов платины по отношению к Bacillus subtilis В4647 и Aspergillus niger составила > 125 мкм (рис. 5).
Выводы Эволюция патогенных микроорганизмов и возникновение различных механизмов их защиты против антимикробных препаратов вынуждает человечество постоянно вести исследования
Таблица 1. Антимикробная активность нитритных моноядерных и биядерных комплексов платины по отношению к микроорганизмам Bacillus subtilis В4647 и Aspergillus niger Table 1. Antimicrobial activity of nitrite mononuclear and binuclear complexes of platinum against Bacillus subtilis B4647 and Aspergillus niger
Комплекс Диаметр зоны ингибирования, мм Bacillus subtilis В4647 Aspergillus niger I [(NO2)2PtII(μ-NO2)2PtII(NH3)2] 6 9 II [(NH3)2PtII(μ-NO2)2PtII(NH3)2](NO3)2 9 11 III [(NH3)2 (NO2)2PtIV(µ-NO2)2PtII(NH3)2](NO3)2 13 13 IV [PtIV(NH3)2(NO2)2Cl2] 7 7 V [PtII(NH3)4]·[PtII(NO2)4] 7 15 XX Антибактериальный препарат 15 15 X Вода – – * результаты представляют собой среднее стандартное отклонение трех независимых экспериментов, проведенных в двухповторностях. * the results are the mean standard deviation of three independent duplicate experiments.
Рисунок 5. Зависимости интенсивности светорассеяния растворов от концентрации комплекса [(NO2)2PtII(μ-NO2)2PtII(NH3)2] Figure 5. Effect of the concentration of the complex [(NO2)2PtII(μ-NO2)2PtII(NH3)2] on the light scattering intensity of solutions
В4647 В4647 Aspergillus
GHI
0
10
20
30
40
02004006008001000
Светорассеяние , %
Концентрация комплекса, мкм В4647 Aspergillus niger
GHI
0
10
20
30
40
02004006008001000
Светорассеяние , %
Концентрация комплекса, мкм В4647 Aspergillus niger
338
Salishcheva O.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 2, pp. 329–342
по поиску новых антимикробных средств. Лекарственные формы на основе комплексов с органическими и неорганическими лигандами проявляют больший антимикробный эффект по сравнению с органическими препаратами. Комплексообразование приводит к проявлению синергетического эффекта между лигандом и комплексообразователем. Большое количество терапевтических агентов представляет собой хелаты платины, железа, иридия, родия, рутения, палладия, кобальта и никеля. При хелатировании лигандов с ионом металла происходящие структурные изменения, включающие изменение липофильности, стабилизацию специфических окислительных состояний, перераспределение электронной плотности, изменение термодинамической устойчи- вости и кинетической инертности замещения, благоприятствуют снижению негативного действия свободного иона металла. Полиядерные платиновые комплексы содержат два или более связанных платиновых центра, которые могут ковалентно связываться с ДНК, способны образовывать совершенно иной вид аддуктов ДНК, по сравнению с моноядерными комплексами, способны к формированию сшивок между цепями ДНК с фиксацией на различных ее участках (рис. 6).
Октаэдрические комплексы платины, являющиеся кинетически и термодинамически инертными соединениями, по сравнению с аналогичными плоскоквадратными комплексами, способны действовать как пролекарства, восстанавливаясь внутри или вне бактериальной клетки. Активность усиливается за счет повышения биологической доступности комплексов. Препараты на основе металлокомплексов облегчают транспорт терапевтических препаратов к бактериальной клетке. Все исследуемые комплексы платины проявляли различные степени ингибирующего воздействия на рост тестируемых видов микроорганизмов в зависимости от состава, строения и заряда координационных центров, термодинамической устойчивости и кинетической лабильности. Более высокий антимикробный эффект показал биядерный комплекс смешанной валентности PtIVPtII [(NH3)2 (NO2)2PtIV(µ-NO2)2PtII(NH3)2](NO3)2 против Bacillus subtilis В4647 и Aspergillus niger. Зона ингибирования данного комплекса сопоставима с зоной ингибирования для антимикробного препарата, который обладает самой высокой активностью по отношению Bacillus subtilis В4647 и Aspergillus niger. Дальнейшие исследования будут нацелены на композиционные смеси комплексов платины с известными антимикробными агентами, а также в отношении других штаммов бактерий.
Критерии авторства А. Ю. Просеков – руководство проектом. О. В. Салищева – синтез комплексов, скрининг антимикробной активности. В. Ф. Долганюк – скрининг антимикробной активности.
Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution A.Yu. Prosekov supervised the research.
O.V. Salishcheva synthesized the complexes and screened their antimicrobial properties. V.F. Dolganyuk screened the antimicrobial activities.
Conflict of interest The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this article.
1. Wang, Y.-P. Metabolite sensing and signaling in cell metabolism / Y.-P. Wang, Q.-Y. Lei // Signal Transduction and Targeted Therapy. – 2018. – Vol. 3. DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-018-0024-7.
2. Андрюков, Б. Г. Антимикробная активность вторичных метаболитов морских бактерий / Б. Г. Андрюков, В. В. Михайлов, Н. Н. Беседнова // Антибиотики и химиотерапия. – 2019. – Т. 64, № 7–8. – С. 44–55.
3. Pinu, F. R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols / F. R. Pinu, S. G. Villas-Boas, R. Aggio // Metabolites. – 2017. – Vol. 7, № 4. DOI: https://doi.org/10.3390/metabo7040053.
4. Chemical synthesis and analysis of antimicrobial and hemolytic activity of structural analogous of a peptide protegrin 1 / P. M. Kopeykin, M. S. Sukhareva, N. V. Lugovkina [et al.] // Медицинский академический журнал. – 2019. – Т. 19, № S. – С. 169–170. DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ191S1169-170.
5. Перспективы использования бактериоцинов нормальной микробиоты в антибактериальной терапии (обзор) / М. И. Заславская, Т. В. Махрова, Н. А. Александрова [и др.] // Современные технологии в медицине. – 2019. – Т. 11, № 3. – С. 136–145. DOI: https://doi.org/10.17691/stm2019.11.3.17.
6. Investigating antibiotic activity of the genus bacillus strains and properties of their bacteriocins in order to develop nextgeneration pharmaceuticals / M. I. Zimina, S. A. Sukhih, O. O. Babich [et al.] // Foods and Raw Materials. – 2016. – Vol. 4, № 2. – P. 92–100. DOI: https://doi.org/10.21179/2308-4057-2016-2-92-100.
7. Determination of the intensity of bacteriocin production by strains of lactic acid bacteria and their effectiveness / M. I. Zimina, A. F. Gazieva, J. Pozo-Dengra [et al.] // Foods and Raw Materials. – 2017. – Vol. 5. № 1. – P. 108–117. DOI: https:// doi.org/10.21179/2308-4057-2017-1-108-117.
8. Валышев, А. В. Антимикробные соединения энтерококков / А. В. Валышев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2014. – № 5. – С. 119–126.
9. Васильченко, А. С. Биологическая активность антимикробных пептидов enterococcus faecium / А. С. Васильченко, Е. А. Рогожин, А. В. Валышев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2015. – № 4. – С. 22–26.
10. Antimicrobial activity of different antimicrobial peptides (AMPs) against clinical methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) / E. Ciandrini, G. Morroni, D. Arzeni [et al.] // Current Topics in Medicinal Chemistry. – 2018. – Vol. 18, № 24. – P. 2116–2126. DOI: https://doi.org/10.2174/1568026618666181022140348.
11. Suresh, M. K. An update on recent developments in the prevention and treatment of Staphylococcus aureus biofilms / M. K. Suresh, R. Biswas, L. Biswas // International Journal of Medical Microbiology. – 2019. – Vol. 309, № 1. – P. 1–12. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2018.11.002.
12. Synergic combinations of antimicrobial peptides (AMPs) against biofilms of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) on polystyrene and medical devices / E. Ciandrini, G. Morroni, O. Cirion [et al.] // Journal of Global Antimicrobial Resistance. – 2019. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jgar.2019.10.022.
13. Al-Tayyar, N. A. Antimicrobial food packaging based on sustainable Bio-based materials for reducing foodborne Pathogens: A review / N. A. Al-Tayyar, A. M. Youssef, R. Al-hindi // Food Chemistry. – 2020. – Vol. 310. DOI: https://doi. org/10.1016/j.foodchem.2019.125915.
14. Антимикробная активность оксида графена / М. Н. Егорова, Л. А. Тарасова, Я. А. Ахременко [и др.] // Вестник Северо-Восточного федерального университета им. М. К. Аммосова. Серия: Медицинские науки. – 2019. – Т. 16, № 3. – С. 11–17. DOI: https://doi.org/10.25587/SVFU.2019.3(16).39459.
15. Antimicrobial potential of ZnO, TiO2 and SiO2 nanoparticles in protecting building materials from biodegradation / L. Dyshlyuk, O. Babich, S. Ivanova [et al.] // International Biodeterioration and Biodegradation. – 2020. – Vol. 146. DOI: https://doi. org/10.1016/j.ibiod.2019.104821.
16. Синтез и антимикробная активность стабилизированных арабиногалактаном наночастиц селена из бис(2фенилэтил)диселенофосфината натрия / М. В. Лесничая, С. Ф. Малышева, Н. А. Белогорлова [и др.] // Известия Академии наук. Серия химическая. – 2019. – № 12. – С. 2245–2251.
17. Jamróz, E. The effect of nanofillers on the functional properties of biopolymer-based films: a review / E. Jamróz, P. Kulawik, P. Kopel // Polymers. – 2019. – Vol. 11, № 4. DOI: https://doi.org/10.3390/polym11040675.
18. Antimicrobial activity of surfactants of microbial origin / T. P. Pirog, D. A. Lutsay, L. V. Kliuchka [et al.] // Biotechnologia Acta. – 2019. – Vol. 12, № 1. – P. 39–57. DOI: https://doi.org/10.15407/biotech12.01.039.
19. Synthesis of new sodium pectinate metal complexes with cobalt and nickel ions and their antimicrobial activity / S. T. Minzanova, D. M. Arkhipova, A. V. Khabibullina [et al.] // Doklady Chemistry. – 2019. – Vol. 487, № 2. – P. 207–211. DOI: https://doi.org/10.1134/S0012500819080044.
20. Synthesis, structural characterization, anti-proliferative and antimicrobial activity of binuclear and mononuclear Pt(II) complexes with perfluoroalkyl-heterocyclic ligands / S. Rubino, I. Pibiri, C. Minacori [et al.] // Inorganica Chimica Acta. – 2018. – Vol. 483. – P. 180–190. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ica.2018.07.039.
21. Synthesis, structure, and antimicrobial activity of (carboxyalkyl)dimethylsulfonium halides / Yu. V. Bakhtiyarova, D. I. Bakhtiyarov, K. A. Ivshin [et al.] // Russian Journal of General Chemistry. – 2017. – Vol. 87, № 9. – P. 1903–1907. DOI: https:// doi.org/10.1134/S107036321709002X.
22. New series of metal complexes by amphiphilic biopolymeric Schiff bases from modified chitosans: Preparation, characterization and effect of molecular weight on its biological applications / H. F. G. Barbosa, M. Attjioui, A. P. G. Ferreira [et al.] // International Journal of Biological Macromolecules. – 2020. – Vol. 145. – P. 417–428. DOI: https://doi.org/10.1016/j. ijbiomac.2019.12.153.
23. Design, synthesis, pharmacological evaluation and DNA interaction studies of binuclear Pt(II) complexes with pyrazolo[1,5-a]pyrimidine scaffold / M. V. Lunagariya, K. P. Thakor, B. N. Waghela [et al.] // Applied Organometallic Chemistry. – 2018. – Vol. 32, № 4. DOI: https://doi.org/10.1002/aoc.4222.
24. New Ni(II), Pd(II) and Pt(II) complexes coordinated to azo pyrazolone ligand with a potent anti-tumor activity: Synthesis, characterization, DFT and DNA cleavage studies / E. A. Bakr, G. B. Al-Hefnawy, M. K. Awad [et al.] // Applied Organometallic Chemistry. – 2018. – Vol. 32, № 2. DOI: https://doi.org/10.1002/aoc.4104.
25. Исследование антимикробной активности кумариновых субстанций в отношении Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa / А. Н. Евстропов, Л. Г. Бурова, И. В. Широких [и др.] // Бактериология. – 2018. – Т. 3, № 2. – С. 16–19.
26. Разнолигандные комплексы платины(II) с биологически активными серу – и азотсодержащими лигандами / А. Н. Азизова, Д. Б. Тагиев, Ш. Г. Касумов [и др.] // Бутлеровские сообщения. – 2017. – Т. 51, № 8. – С. 27–32.
27. Комплексы четырехвалентной платины: синтез, строение, антимикробная активность / А. Р. Ткачёва, В. В. Шарутин, О. К. Шарутина [et al.] // Журнал общей химии. – 2020. – Т. 90, № 4. – С. 599–603. DOI: https://doi. org/10.31857/S0044460X20040150.
28. Galanski, M. Searching for the magic bullet: anticancer platinum drugs which can be accumulated or activated in the tumor tissue / M. Galanski, B. K. Keppler // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. – 2007. – Vol. 7, № 1. – P. 55–73. DOI: https://doi.org/10.2174/187152007779314017.
29. Салищева, О. В. Биядерные комплексы платины(II) и палладия(II) с нитритными мостиками / О. В. Салищева, Н. А. Старкина, М. И. Гельфман // Научное обозрение. – 2006. – № 1. – С. 47–50.
30. Салищева, О. В. Биядерные комплексы платины смешанной валентности / О. В. Салищева, Н. А. Старкина, М. И. Гельфман // Современные наукоемкие технологии. – 2007. – № 8. – С. 36.
31. Spectroscopic, theoretical, and antibacterial approach in the characterization of 5-methyl-5-(3-pyridyl)-2,4imidazolidenedione ligand and of its platinum and palladium complexes / S. J. Sabounchei, P. Shahriary, S. Salehzadeh [et al.] // Comptes Rendus Chimie. – 2015. – Vol. 18, № 5. – Р. 564–572. DOI: https://doi.org/10.1016/j.crci.2014.04.013.
32. Trans-influence of a nitro group in platinum complexes / M. I. Gel’fman, N. A. Starkina, O. V. Salishcheva [et al.] // Russian Journal of Inorganic Chemistry. – 2007. – Vol. 52, № 10. – P. 1551–1556. DOI: https://doi.org/10.1134/S0036023607100130.
