сотрудник
Россия
, Россия
, Россия
, Россия
, Россия
, Россия
Гребешок приморский Mizuhopecten yessoensis является одним из самых распространенных объектов разведения в Приморском крае и обычно выращивается двумя способами: садковым и донным. Садковый (индустриальный) вариант культивирования наиболее развит, но требует пристального внимания, т. к. неправильное планирование хозяйственной деятельности может повлиять на выживаемость гребешка, что, в свою очередь, приводит к значительным финансовым потерям. В последнее время марикультурные фермы разных стран стали часто сталкиваться с массовой гибелью культивируемых гидробионтов, при этом причины подобного явления не совсем ясны, и зачастую их выявление требует большого количества времени, а также финансовых затрат. Использование прогностических механизмов на основе биомаркеров может помочь выявить скрытые угрозы в организме культивируемых гребешков, ведущие к массовой гибели. Оценка состояния моллюсков на более ранних стадиях развития позволит спрогнозировать и предупредить значительные потери среди товарных особей. Проанализированы показатели биомаркеров и смертности гребешка приморского Mizuhopecten yessoensis, культивируемого именно садковым способом. Проведена оценка разновозрастных групп моллюсков 2-х поколений с разницей в 10 лет. В ходе исследования обнаружено, что с увеличением количества повреждений ДНК и активным накоплением малонового диальдегида в тканях риск гибели моллюсков возрастает. Отмечено, что у гребешков возраста 1+ поколения 2015 г. в пищеварительной железе и жабрах был зарегистрирован высокий уровень повреждения молекулы ДНК и малонового диальдегида, что впоследствии привело к гибели практически всех товарных особей возраста 3+
аквакультура, моллюски, Mizuhopecten yessoensis, повреждение молекулы ДНК, малоновый диальдегид, массовая гибель
Введение Аквакультура является одной из важных и перспективных отраслей мирового рыбного хо-зяйства, которая способствует увеличению и сохранению биологических ресурсов. Мировое производство аквакультуры в 2014 г. достигло 73,8 млн т, что эквивалентно 160,2 млрд долл. США в точке первой продажи, из них 16,1 млн т составляют моллюски (на 19 млрд долл. США) [1]. Согласно данным ФАО (продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН) в 2016 г. производство в морской и прибрежной аквакультуре практически приблизилось к 30 млн т (67,4 млрд долл. США), из них на двустворчатые моллюски приходится 16,9 млн т (58,8 % общего объема производства). При этом, по расчетам специалистов, общее производство рыболовства и аквакультуры к 2030 г. может вырасти до 201 млн т [2]. В последнее время многие марикультурные хозяйства, использующие методы садкового культивирования, начали сталкиваться с массовой гибелью выращиваемых гидробионтов [3], что сопровождается большими финансовыми потерями. Массовая смертность отмечена у разных видов культивируемых двустворчатых моллюсков: устриц, гребешков и мидий. Зачастую она связана с воздействием паразитов, риккетсиоподобных организмов [4, 5], вирусов, бактерий [6, 7] и пр. Также существуют иные предпосылки, влияющие на выживаемость гидробионтов, такие как факторы окружающей среды, чрезмерная плотность посадки, инбридинг [4]. Для дальнейшего устойчивого развития хозяйств марикультуры требуется тщательное изучение последствий промышленного культивирования гидробионтов для окружающей среды, а также постоянная оценка физиологического состояния культивируемых гидробионтов, позволяющая на ранних стадиях оперативно выявлять патологические изменения, которые, в свою очередь, могут привести к массовой гибели культивируемых объектов [7, 8]. Прибрежная полоса Приморского края является одним из наиболее перспективных регио-нов России для развития марикультуры благодаря хорошим климатическим условиям и наличию значительных по площади акваторий, особенно в южной части края, пригодных для культивиро-вания гидробионтов. На сегодняшний день здесь насчитывается более 50 действующих марикультурных хозяйств, которые занимаются разведением наиболее ценных видов моллюсков, иглокожих и водорослей [9]. На протяжении последних десятилетий гребешок приморский Mizuhopecten yessoensis является одним из традиционных культивируемых морских двустворчатых моллюсков в Приморском крае. Однако в последние годы некоторые хозяйства сталкиваются с массовой гибелью моллюсков в процессе выращивания. Цель данной работы – изучение эффективности использования биомаркеров в качестве прогностических сигналов для выявления причин гибели M. yessoensis разных поколений. Материал и методика исследования Исследование проводили на гребешках разных поколений с интервалом 10 лет, культиви-руемых садковым способом в марикультурном хозяйстве, расположенном в бухте Северной (Славянский залив) (рис. 1). Рис. 1. Карта-схема района работ В работе сравнивали два поколения M. yessoensis: первое – нерест 2005 г., второе – нерест 2015 г. Моллюсков отбирали в посленерестовый период (октябрь), в возрасте 1+, 2+ и 3+ для нереста 2005 г. и 1+, 2+ для нереста 2015 г., т. к. после летнего периода была зарегистрирована массовая смертность моллюсков возраста 3+. Для исследования моллюски были изъяты из садков, препарированы на льду, из них вы-делены жабры и пищеварительная железа. Определение уровня повреждения молекулы ДНК при использовании кометного анализа проводилось сразу после извлечения тканей из моллюсков в помещениях научно-производственного департамента Дальрыбвтуза, расположенного в бухте Северная. Остатки тканей, предназначающихся для определения малонового диальдеги-да (МДА), немедленно замораживали в жидком азоте (сосуд Дьюара СДС-6М) и транспортиро-вали в лабораторию для дальнейшей обработки. Определение количества повреждений молекулы ДНК. При определении количества повреждений в молекуле ДНК использовали щелочной вариант кометного анализа [10], успешно адаптированного к морским организмам. Данный подход является перспективным современным диагностическим и прогностическим инструментом для выявления скрытых патологических сдвигов в любых организмах [11]. Визуализацию и регистрацию ДНК-комет осуществляли с помощью сканирующего флуо-ресцентного микроскопа (Zeiss, AxioImager A1), оснащенного цифровой фотокамерой AxioCam MRc. Для обработки цифровых изображений была использована компьютерная программа CometScore Freeware v1.5, которая позволяет вычислять различные параметры комет, указыва-ющие на степень повреждения клеточной ДНК. Для каждой кометы рассчитывали долю ДНК в хвосте кометы (DNAt). В исследованных группах гребешков анализировали по 15 гель-слайдов (1 слайд = 1 особь), содержащих не менее 50 комет в каждом. Определение содержания МДА. Содержание МДА – продукта окислительной деградации жирных кислот – определяли в тканях и субклеточных фракциях по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой [12]. Измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1650 PC. Относительное содержание МДА выражали в нмолях в расчете на грамм сырого веса. Исследование проводили в 15 параллельных пробах, где 1 проба = 1 особь. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 и Microsoft Excel 2016. Оценку проводили по каждому эксперименту путем сравнения среднегрупповых показателей (Р < 0,01 с использованием критерия Манна – Уитни). Коэффициенты корреляции были оценены с использованием регрессии Пирсона. Результаты и обсуждение В результате исследования установлено, что у годовалых (1+) и двухгодовалых (2+) гре-бешков поколения 2015 г. степень деградации молекулы ДНК в жабрах и пищеварительной же-лезе оказалась значительно выше, чем у гребешков поколения 2005 г. (рис. 2). Рис. 2. Степень повреждения молекулы ДНК жабр и пищеварительной железы M. yessoensis поколений 2005 и 2015г.: «*» – достоверные отличия между поколениями P = 99 % (критерий Манна – Уитни); а, b –достоверные отличия между разными возрастами одного поколения, р < 0,01 (регрессия Пирсона) Очевидно, что уровень повреждения молекулы ДНК у моллюсков поколения 2005 г. – как в жабрах, так и в пищеварительной железе – у всех исследованных возрастных групп находился практически на одном уровне и не превышал 20 %. При этом достоверных различий между раз-новозрастными группами нереста 2005 г. выявлено не было. У M. yessoensis поколения 2015 г. уровни повреждения ДНК жабр и пищеварительной же-лезы также достоверно не отличались у разновозрастных особей. Достоверные отличия отмече-ны у годовалых и двухгодовалых особей поколений 2005 и 2015 г., так, в жабрах и пищевари-тельной железе гребешков поколения 2015 г. уровень повреждения молекулы ДНК был выше в в среднем в 2,5 раза, в отличие от моллюсков поколения 2005 г. Содержание МДА в тканях гребешков (рис. 3) имеет сходную картину с уровнем повре-ждения ДНК. Рис. 3. Уровень МДА в жабрах и пищеварительной железе M. yessoensis поколений 2005 и 2015 гг.: «*» – достоверные отличия между поколениями P = 99 % (критерий Манна – Уитни); а, b – достоверные отличия между разными возрастами одного поколения, р < 0,01 (регрессия Пирсона) У M. yessoensis нереста 2015 г. данный показатель значительно выше: практически в 3 ра-за в жабрах и более чем в 5 раз в пищеварительной железе, чем у гребешков поколения 2005 г. (рис. 3). Так, у поколения 2005 г. концентрация МДА в жабрах находилась в пределах 2–2,5 нмоль/г сырого веса, в пищеварительной железе 5–7 нмоль/г. Как видно из полученных результатов, достоверных различий между возрастными группами в пределах одного поколения выявлено не было. При этом достоверно различались между собой одновозрастные группы двух исследованных нами поколений моллюсков. Также была отмечена значительная положительная корреляция между уровнем МДА в тканях и процентом повреждений ДНК в исследованных тканях у двух разных поколений гребешков (P < 0,05). Следует отметить, что в октябре 2017 и 2018 гг. наблюдалась смертность моллюсков по-коления 2015 г.: в возрасте 2+ – более чем 50 %, в возрасте 3+ – 95 %. При этом у поколения 2005 г. массовой гибели не наблюдалось, смертность составляла менее 20 % во всех возрастных группах. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что поврежденность моле-кулы ДНК клеток жабр и пищеварительной железы M. yessoensis при значениях более 40 % (см. рис. 2) и высокие уровни МДА (см. рис. 3) в тканях являются сигналами необратимых по-следствий, протекающих в организме, которые приводят к массовой гибели гидробионтов. Из-вестно, что МДА является широко используемым индикатором развития окислительного стрес-са, при этом содержание высоких концентраций МДА в тканях (см. рис. 3) само по себе может приводить к повреждению молекулы ДНК и мутациям [13]. Скорее всего, в периоды массовой гибели моллюски находятся в состоянии оксидативного стресса, что подтверждается значитель-ным увеличением содержанием МДА в тканях моллюсков, при этом повреждение молекулы ДНК достигает критических значений, практически 50 %. Разные исследователи отмечают, что пик смертности в гребешковых хозяйствах соответ-ствует поздней части нереста [4–6]. Считается, что именно стресс, связанный с нерестом, является основным фактором гибели моллюсков из-за ослабления основных защитных систем организма (иммунной, антиоксидантной, репаративной), и именно в этот период организм подвержен различным инфекциям и инвазиям [4]. Еще к одной из предпосылок высокой смертности гидробионтов некоторые авторы относят чрезмерную плотность посадки, которая способствует развитию инфекционных процессов, а также имбридинг, ослабляющий защитный физиологический потенциал культивируемых моллюсков [3–8]. Наши результаты подтверждают данные выводы, т. к. именно несостоятельность системы репарации молекулы ДНК приводит к накоплению по-вреждений в ее структуре, а ослабление антиоксидантной защиты способствует накоплению продуктов перекисного окисления липидов в тканях. Заключение Анализ экспериментальных данных свидетельствовал о том, что моллюски поколения 2015 г. испытывали выраженный окислительный стресс, и это привело к повышению содержа-ния МДА в тканях и значительному повреждению ДНК. Считаем, что данные биомаркеры яв-ляются ранними и чувствительными индикаторами, отражающими физиологическое состояние культивируемых моллюсков, а также сигналами о возникновении развития патологий, ведущих к массовой гибели гидробионтов. Так, при уровне повреждения молекулы ДНК у гребешков возраста 1+ в диапазоне 40–50 % можно предвидеть предстоящие экономические потери в связи с массовой гибелью гидробионтов в следующем году. Конечно, для того чтобы с уверенностью делать такие прогнозы, необходимо собрать больше данных о поврежденности генома и уровнях содержания МДА на разных и более ранних возрастных стадиях моллюсков. Результаты, полученные в данной работе, могут быть использованы для начала нового и перспективного направления по прогнозированию устойчивости не только хозяйств марикультуры, но и есте-ственных экосистем в тех морских акваториях, которые используются для промышленного вос-производства гидробионтов.
1. ФАO. 2016. Cостояние мирового рыболовства и аквакультуры 2016. Вклад в обеспечение всеобщей продовольственной безопасности и питания. URL: http://www.fao.org/publications/sofia/2016/ru/ (дата обращения: 15.03.2020).
2. ФАO. 2018. Cостояние мирового рыболовства и аквакультуры 2018. Достижение целей устойчивого развития. URL: http://www.fao.org/family-farming/detail/ru/c/1145056/ (дата обращения: 15.03.2020).
3. Xiao J., Ford S. E., Yang H., Zhang G., Zhang F., Guo X. Studies on mass summer mortality of cul-tured zhikong scallops (Chlamys farreri Jones et Preston) in China // Aquaculture 250 (3–4). 2005. P. 602–615.
4. Lan Y., Ye T., Xue Y., Liu H., Zhang H., Cheng D., Zhao M., Zhang Y., Li S., Ma H., Zheng H. Phy-iological and immunological responses to mass mortality in noble scallop Chlamys nobilis cultured in Nan'ao waters of Shantou, China // Fish and Shellfish Immunology. 2018. N. 82. P. 453–459.
5. Chao L., Fucun W. U., Huayong Q., Guofan Z. Relationships of growth and mortality to enzymatic activity, and the relative mRNA expression of cultured scallops Patinopecten yessoensis in the Yellow Sea, China // Journal of Oceanology and Limnology. 2019. V. 37. N. 4. P. 1409–1422.
6. Zhang X., Zhu M., Li R., Wang Z., Xia B., Zhang L. Density-dependent mortality of the scallop Chlamys farreri in grow-out cuture // Aquaculture research. 2006. N. 37. P. 842–844.
7. Read P. A., Fernandes T. F. Management of environmental impacts of marine aquaculture in Europe // Aquaculture. 2003. V. 226. P. 139–163.
8. Ansari Z. A., Ingole B. S., Parulekar A. H. Effect of high organic enrichment of benthic polychaete population in an estuary // Marine Pollution Bulletin. 1986. N. 17. P. 361–365.
9. Коваль И. В., Овчинникова И. А. Состояние и тенденции развития аквакультуры в Приморском крае // Вестн. Тихоокеан. гос. эконом. ун-та. 2013. № 1 (65). С. 36–47.
10. Collins A. R. Investigating oxidative DNA damage and its pepair using the comet assay // Mutation Research. 2009. V. 681. P. 24–32.
11. Singh N. P., McCoy M. T., Tice R. R., Schneider E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells // Experimenta Cell Research. 1988. V. 175. P. 184–191.
12. Buege J. A., Aust S. D. Microsomal lipid peroxidation // Methods in Enzymology. N.Y.: Academic Press, 1978. V. 52. P. 302–310.
13. Cooke M. S., Evans M. D., Dizdaroglu M., Lunec J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease // The FASEB Journal. 2003. V. 17. N. 10. P. 1195–1214.
