, Россия
, Россия
УДК 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
ГРНТИ 68.01 Общие вопросы сельского хозяйства
Цель исследования – оптимизация условий культивирования in vitro жимолости синей, малины и земляники. Для инициации эксплантов контрольной (к.) для всех культур была среда Мурасиге-Скуга (1/2МС), для жимолости дополнительно использовали 1/2 МС модифицированную (мод.) с уменьшенным на 15 % содержанием NH4, Woodi Plant Medium (1/2 WPM); для малины – Quoirin-Lepoivre (1/2 QL) и 1/2 Андерсона. Микроразмножение и укоренение жимолости проводили на средах МС мод., WPM; малины – QL, Андерсона; земляники – МС мод. с Силиплантом, Боксю; контрольная – МС. В оптимальную для каждой культуры среду вносили регуляторы роста: 6-бензиламинопурин (6-БАП), гиббереллиновая кислота (ГК), продукты жизнедеятельности личинок большой восковой моли (ПЖВМ), индолил-3-масляная кислота (ИМК), Силиплант, ЭкоФус, НВ-101. На этапах микроразмножения и укоренения на всех культурах изучали действие светодиодных фитооблучателей (СД-облучатель) с сочетанием в спектре красного, синего и белого света 2:1:1, 1:1:1, 2:1 соответственно, СД-облучателей с меняющимся спектром и мигающего. На среде 1/2 WPM выживаемость эксплантов жимолости составила 62,2 % (27,9 % к.). При использовании СД 2К:1С:1Б достигнут наибольший коэффициент размножения (КР) 5,1 (2,6 к.) на МС мод.+6-БАП 1,0 мг/л+кинетин 0,5 мг/л и высокая укореняемость 89,0 % (76,0 % к.) на МС мод.+ИМК 0,5 мг/л. Культивирование малины красной на QL+6-БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л и облучение СД 2К:1С:1Б обеспечили КР 5,3 (2,7 к.), добавление в QL ИМК 0,5 мг/л+НВ-101 100 мкл/л и облучение СД 1К:1С:1Б способствовало 100 % укореняемости. Внесение в QL 6-БАП 1,0 мг/л+ИМК 0,2 мг/л+ГК 0,5 мг/л и освещение СД 1К:1С:1Б увеличили КР малины ремонтантной в 1,6 раза (с 2,6 до 4,1), а использование QL+ИМК 0,5 мг/л+НВ-101 50 мкл/л и СД 2К:1С:1Б повысило ее укореняемость до 96 % (67 % к.). Облучение СД с меняющимся спектром при культивировании на МС+Силиплант+ЭкоФус по 0,5 мл/л обеспечило КР земляники садовой 5,9 (3,8 к.), земляники ремонтантной – 7,4 (5,6 к.) на МС+НВ-101 100 мкл/л. Добавление в МС ИМК 0,5 мг/л+НВ-101 100 мкл/л способствовало укоренению земляники садовой 100 % при использовании СД-облучателя с меняющимся спектром, а земляники ремонтантной – с мигающим СД-облучателем
жимолость синяя (Lonicera caerulea), малина обыкновенная (Rubus idaeus), земляника садовая (Fragaria ananassa), клональное микроразмножение, светодиодный фитооблучатель
Клональное микроразмножение ягодных и других растений – наиболее надежный и перспективный метод, позволяющий производить посадочный материал, свободный от различных заболеваний [1]. Работу в лабораторных условиях осуществляют круглый год, нужную партию растений можно сформировать к определенному сроку, иногда за очень короткий промежуток времени [2].
Оптимальная питательная среда, регуляторы роста и спектральный состав света – самые важные факторы биопродуктивности растений in vitro [3].
При производстве посадочного материала метод клонального микроразмножения дает ряд преимуществ, по сравнению с традиционным черенкованием и прививкой, поэтому также очень важен вопрос экономической эффективности [4].
Цель исследований – совершенствование биотехнологических методов выращивания жимолости синей, малины и земляники.
Условия, материалы и методы. Эксперименты проводили в 2012–2020 гг. согласно методическим указаниям «Технологический процесс получения оздоровленного от вирусов посадочного материала плодовых и ягодных культур» (2013) и ГОСТ Р 54051-2010 «Плодовые и ягодные культуры. Стерильные культуры и адаптированные микрорастения. Технические условия».
Объектами служили: на этапе введения в культуру ткани – инициальные экспланты, на этапе собственно микроразмножения – микрочеренки, на этапе адаптации – микрорастения жимолости синей, малины красной и ремонтантной, земляники садовой и ремонтантной.
На этапе введения в стерильную культуру для всех культур использовали питательные среды с половинной дозой макро- и микросолей, контрольной была среда Мурасиге-Скуга (1/2МС). Дополнительно изучали возможность использования для жимолости 1/2 МС модифицированную с уменьшенным на 15 %, по сравнению с базовой МС, содержанием аммиачного азота NH4 и Woodi Plant Medium (1/2 WPM); для малины – Quoirin-Lepoivre (1/2 QL) и 1/2 Андерсона. Для земляники на этом этапе другие питательные среды не использовали.
Стерилизовали экспланты 33 %-ным раствором пергидроли.
На этапах собственно микроразмножения (5 пассажей) и укоренения использовали следующие питательные среды: для жимолости –
МС модифицированная, WPM; для малины – QL, Андерсона; для земляники – МС модифицированная Силиплантом, Боксю; контрольной для всех культур служила среда МС. В оптимально выделившуюся для каждой культуры питательную среду перед автоклавированием вносили различные регуляторы роста: 6-БАП – 6-бензиламинопурин, ГК – гиббереллиновая кислота, ПЖВМ – продукты жизнедеятельности личинок большой восковой моли, ИМК – индолил-3-масляная кислота (табл. 1).
Дополнительно на этапах собственно микроразмножения и укоренения на всех культурах изучали действие светодиодных фитооблучателей (СД-облучатель) с сочетанием в спектре красного, синего и белого света соответственно 2:1:1, 1:1:1, 2:1 [6], СД-облучателей с меняющимся спектром и мигающего. Последние два фитооблучателя применяли также на этапе адаптации земляники. Контрольным был люминесцентный фитооблучатель. Фотопериод составлял 14 ч, освещенность – 75…85 мМоль/м2×сек-1, 6500 К, температура воздуха – 22…27 0С, влажность – 50…60 % [7]. Экспериментальные светодиодные фитооблучатели с различными характеристиками, которые, наряду с экономией электроэнергии, улучшают качество освещения микрорастений, разработаны в ФГБОУ «Ижевская ГСХА» [8].
На этапе адаптации использовали субстраты на основе низинного торфа и речного песка в соотношении 3:1 (контроль), низинного торфа и вермикулита 3:1, верхового торфа [9].
Препараты с фитозащитными и ростостимулирующими свойствами применяли путем опрыскивания водными растворами [10].
В каждом варианте работали с объемом выборки 10 единиц, все опыты проводили в трехкратной повторности. Экспериментальные данные обработаны методом дисперсионного анализа по Доспехову Б. А. (М., 2001).
Анализ и обсуждение результатов. На этапе введения в стерильную культуру оптимальной для всех сортов жимолости была питательная среда 1/2 WPM, обеспечившая значительное увеличение выживаемости эксплантов до 62,2 %, в сравнении с контрольной
(27,9 %). Культивирование на среде 1/2 QL повышало выживаемость апексов малины красной в 1,7 раза, ремонтантной – в 1,3 раза. Выживаемость эксплантов земляники на среде 1/2 МС составила 81,5 %, поэтому в подборе оптимальной питательной среды на этапе введения в культуру не было необходимости.
Культивирование жимолости синей на питательной среде МС модифицированной с добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + кинетин 0,5 мг/л при освещении светодиодным фитооблучателем со спектром 2К:1С:1Б способствовало увеличению коэффициента размножения (КР), в сравнении с контролем (2,6), в 2 раза
(табл. 2). Добавление в указанных условиях индуктора ризогенеза ИМК 0,5 мг/л обеспечило существенное увеличение укореняемости микрочеренков жимолости синей, в сравнении с контролем (76,0 %), до 89,0 %.
Культивирование малины красной на среде QL с добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л при облучении СД 2К:1С:1Б повышало КР, в сравнении с контролем (2,7), практически в 2,0 раза (5,3). Внесение в питательную среду ГК 0,5 мг/л обеспечило увеличение высоты микрочеренков малины красной, в сравнении с контролем (1,2 см), до 1,8 см с последующей высадкой их на укоренение без этапа элонгации (удлинения). Укоренение микрочеренков малины красной на питательной среде QL с добавлением ИМК 0,5 мг/л + НВ-101 100 мкл/л и освещении СД 1К:1С:1Б обеспечило 100 %-ный результат.
Культивирование малины ремонтантной на среде QL с добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + ИМК 0,2 мг/л + ГК 0,5 мг/л при облучении СД
1К:1С:1Б повышало КР, в сравнении с контролем (2,6), в 1,6 раза. Внесение в питательную среду ГК 0,5 мг/л обеспечило увеличение высоты микрочеренков малины ремонтантной, в сравнении с контролем (1,5 см), в среднем до 3,0 см, что позволило высадить 70 % микрочеренков на укоренение также без этапа элонгации. Значительное увеличение укореняемости малины ремонтантной (до 96 %, при 67 % в контроле) отмечали при совместном внесении в среду QL ИМК 0,5 мг/л и НВ-101 50 мкл/л при облучении СД 2К:1С:1Б.
Максимальный в опыте КР микрочеренков земляники садовой (5,9) зафиксирован на среде МС при совместном использовании Силипланта и ЭкоФуса в концентрациях 0,5 мл/л и освещении СД с меняющимся спектром, в контроле величина этого показателя была на 2,1 меньше. Сокращению этапа укоренения микрочеренков земляники садовой до 10 суток (в контроле 20 суток) и 100 %-ному укоренению способствовало добавление в питательную среду НВ-101 в концентрации 100 мкл/л и освещение светодиодным фитооблучателем с меняющимся спектром. У земляники ремонтантной самый высокий КР отмечен также на среде МС с НВ-101 в концентрации 100 мкл/л при освещении светодиодным фитооблучателем с меняющимся спектром – 7,4 (в контроле 5,6). Укореняемость микрочеренков земляники ремонтантной составила 100 % на этой же питательной среде с добавлением ИМК
0,5 мг/л и НВ-101 в концентрации 100 мкл/л, но при освещении мигающим светодиодным фитооблучателем.
Применение Рибав-Экстра и освещение светодиодным мигающим фитооблучателем активизировало ризогенез микрочеренков земляники. Укореняемость земляники садовой на уровне 100 % отмечали через 10 суток после высадки при концентрации препарата 1,5 мл/л составила, ремонтантной – через 20 суток при концентрации 1,0 мл/л. Внесение в питательную среду ПЖВМ во всех дозах также значительно увеличивало укореняемость микрочеренков: у земляники садовой она достигала 86,4…100 %, ремонтантной – 88,9…100 % [11].
К концу этапа укорененные микрочеренки жимолости синей, малины и земляники соответствовали ГОСТ Р 54051-2010.
На этапе адаптации увеличение приживаемости микрорастений жимолости до 93,4 % обеспечило использование субстрата на основе верхового торфа в сочетании с обработкой 0,01 %-ным водным раствором НВ-101. В этом варианте выход кондиционных адаптированных микрорастений жимолости достиг
91,1 % при 67,9 % в контроле.
Выход 100 % адаптированных микрорастений малины красной и ремонтантной отмечен при использовании общепринятой методики.
Адаптацию укорененных микрочеренков земляники со 100 % приживаемостью обеспечило опрыскивание 0,1 %-ным водным раствором Силипланта и обработка 0,05 % смешанным раствором Силипланта с ЭкоФусом при освещении светодиодным фитооблучателем с меняющимся спектром. Кроме того, приживаемость 100 % микрорастений земляники садовой отмечали при опрыскивании 0,4 %-ным водным раствором ПЖВМ; приживаемость 99,8 % микрорастений земляники ремонтантной наблюдали при опрыскивании 0,6 %-ным водным раствором ПЖВМ.
При соблюдении перечисленных условий к концу этапа адаптированные микрорастения
жимолости синей, малины и земляники соответствовали ГОСТ Р 54051-2010.
Подбор оптимальных питательных сред, регуляторов роста и светового режима в клональном микроразмножении жимолости синей, малины и земляники позволил значительно увеличить КР и выход адаптированных микрорастений. Результаты этих исследований легли в основу усовершенствованных методик для клонального микроразмножения изучаемых культур.
Применение улучшенной методики увеличило выход адаптированных микрорастений жимолости синей в 3,8 раза, снизило их себестоимость – на 20,6 % (табл. 3). Это позволило в конечном итоге произвести стандартный посадочный материал с закрытой корневой системой в течение одного вегетационного периода при уровне рентабельности 113,0 %, что на 32,0 % выше, чем по традиционной методике. Соблюдение усовершенствованной методики клонального микроразмножения позволило увеличить выход адаптированных микрорастений малины красной в 7,1 раза, малины ремонтантной – в 3,3 раза. Уровень рентабельности составил соответственно
155 % и 145 %. Использование усовершенствованной методики увеличило выход микрорастений земляники садовой в 2,1 раза, ремонтантной – в 1,9 раза, снизило себестоимость одного адаптированного микрорастения соответственно на 33,0 % и 52,0 %, повысило уровень рентабельности до 80,7 и 134,4 % соответственно.
Выводы. Оптимальной питательной средой для жимолости синей на этапе введения в культуру in vitro оказалась 1/2 WPM, обеспечивающая выживаемость эксплантов 62,2 %. Питательная среда МС с пониженным на 15 % содержанием аммиачного азота, добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + кинетин 0,5 мг/л при освещении СД-облучателем со спектром 2К:1С:1Б увеличивала КР до 5,1. Укореняемость микрочеренков жимолости синей на питательной среде МС мод. с добавлением ИМК 0,5 мг/л при освещении СД-облучателем 2К:1С:1Б достигала 89,0 %. Условия адаптации микрорастений жимолости синей в субстрате на основе верхового торфа с опрыскиванием 0,01 %-ным раствором НВ-101 обеспечили приживаемость жимолости синей до
93,4 %, при этом выход кондиционных адаптированных микрорастений составил 91,1 %.
На всех этапах микроразмножения in vitro малины оптимальной питательной средой была QL. Добавление в эту среду 6-БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л при облучении СД-облучателем 2К:1С:1Б обеспечило наибольший коэффициент размножения (5,3), а внесение ИМК 0,5 мг/л + НВ-101 100мкл/л и освещение СД-облучателем 1К:1С:1Б – 100 %-ную укореняемость микрочеренков малины красной. Увеличить КР малины ремонтантной до 4,1 позволило добавление в среду QL 6-БАП 1,0 мг/л + ИМК 0,2 мг/л + ГК 0,5 мг/л и облучение СД 1К:1С:1Б, а внесение ИМК 0,5 мг/л + НВ-101 50мкл/л и облучение СД 2К:1С:1Б повысило укореняемость микрочеренков до 96 %.
Для культивирования in vitro земляники оптимальной питательной средой оказалась МС. При внесении в нее Силипланта и ЭкоФуса по 0,5 мл/л и освещении СД с меняющимся спектром отмечен максимальный в опыте коэффициент размножения микрочеренков земляники садовой (5,9), а использование НВ-101 в концентрации 100 мкл/л при освещении тем же фитооблучателем обеспечило самый высокий КР земляники ремонтантной (7,4). Добавление в среду МС НВ-101 в концентрации 100 мкл/л способствовало 100 %-ному укоренению микрочеренков земляники садовой при освещении СД-облучателем с меняющимся спектром, а земляники ремонтантной – при использовании мигающего СД-облучателя. Адаптация земляники в субстрате на основе верхового торфа с опрыскиванием 0,1 %-ным раствором Силипланта, 0,05 %-ным раствором Силипланта с ЭкоФусом и 0,4 %-ным раствором ПЖВМ при освещении СД-облучателем с меняющимся спектром обеспечила приживаемость 100 % микрорастений.
1. Куликов И. М., Минаков И. А. Развитие садоводства в России: тенденции, проблемы, перспективы // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. 2017. С. 9–15.
2. Современный биотехнологический подход к производству посадочного материала садовых культур / Т. В. Плаксина, И. Д. Бородулина, Л. С. Ворохобова и др. // Аграрная наука – сельскому хозяйству: материалы XII Международной научно-практической конференции. Барнаул: Алтайский государственный аграрный университет. 2017. С. 239–241.
3. Маркова М. Г., Сомова Е. Н. Влияние регуляторов роста и светодиодных фитооблучателей на адаптацию земляники садовой // Вестник российской сельскохозяйственной науки. 2019. № 6. С. 12–15. doi:10.30850/vrsn/2019/6/12-15.
4. Шипунова А. А. Клональное микроразмножение плодовых и декоративных культур в условиях промышленного производства // Биотехнология как инструмент сохранения разнообразия растительного мира (физиолого-биохимические, эмбриологические, генетические и правовые аспекты): материалы VII Междунар. научно-практ. конф., посвящ. 30-летию отдела биотехнологии растений Никитского ботанического сада. Симферополь: Изд-во типография «Ариал», 2016. С. 138–139.
5. Пат. 2715695 РФ. МПК Способ укоренения ремонтантной земляники в культуре in vitro / М. Г. Маркова, Е. Н. Сомова, А. С. Осокина и др. // Заявлено 24.05.2019; опубл. 02.03.2020. Бюл. № 7. 5 с.
6. Пат. 127286 РФ. МПК. Полезная модель «Светодиодная система для облучения меристемных растений» / Р. А. Валеев, С. И. Юран, Н. П. Кондратьева и др. // Заявлено 17.07.2012; опубл. 27.04.2013 г. 5с.
7. Supplemental blue led lighting array to improve the signal quality in hyperspectral imaging of plants / A. K. Mahlein, E. C. Oerke, H. W. Dehne, et al. // Sensors. 2015. Vol. 15. No. 6. P. 12834–12840.
8. Эффективность микропроцессорной системы автоматического управления работой светодиодных облучательных установок / Н. П. Кондратьева, Р. И. Ильясов, Р. Г. Большин и др. // Сельскохозяйственные машины и технологии. 2018. № 3. С. 32–37.
9. Колбанова Е. В. Влияние фитогормонов в составе питательной среды на пролиферацию у растений-регенерантов сортов жимолости синей (Lonicera caerulea L. var. Kamtschatica) // Весці нацыянальнай акадэміі навук Беларусі. Серыя бiялагiчных навук. Мінск // 2020. Т. 65. № 1. С. 88–97. Doi:10.29235/1029-8940-2020-56-1-88-97.
10. Adaptation of regenerated strawberry plants to ex vitro using biological preparations / A. Subin, G. Tkalenko, V. Boroday, et al. // Агробіологія. 2016. № 2 (128). C. 85–90.
11. Маркова М. Г., Сомова Е. Н. Использование продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли в клональном микроразмножении земляники садовой // Вестник российской сельскохозяйственной науки. 2020. № 4. С. 66–68. doi:10.30850/vrsn/2020/4/66-68.
