сотрудник
, Россия
сотрудник
, Россия
Исследованы биологические показатели развития Daphnia magna на критических стадиях онтогенеза под воздействием водных растворов экотоксикантов: нитробензола и трихлорбензола. Показано, что периоды размножения и развития у Daphnia magna являются решающими среди прочих показателей: физиологических, биохимических. Фактически весь период эмбриогенеза у дафний является достаточно уязвимым по сравнению с дальнейшими этапами развития. У дафний при действии растворов выбранных для исследования экотоксикантов в первую очередь снижается плодовитость и происходит задержка оогенеза. Следующим по чувствительности этапом будет количество сброшенных карапаксов. Наименее чувствительный параметр – выживаемость взрослых особей. Усиление отдаленного токсического эффекта в трех поколениях дафний не было выявлено в процессе исследования. Тест-объект Daphnia magna во всех проведенных опытах показал высокую чувствительность к нитробензолу и трихлорбензолу как к загрязнителям водной среды. За основные онтогенетические параметры в оценке качества вод предпочтительно брать плодовитость Daphnia magna и нарушение процессов развития на предзародышевых стадиях. По параметру «вы-живаемость» выявлена максимально допустимая концентрация исследуемых бензольных соединений – 0,01 мг/л, которая была установлена по наиболее чувствительным показателям и критическим стадиям онтогенеза.
гидробионты, токсикант, тест-объект, дафния, нитробензол, трихлорбензол, допустимая концентрация
Введение Изучение индивидуального развития гидробионтов в настоящее время заключается в исследовании процессов межклеточного взаимодействия, от которого и зависит как поведение, так и положение клеток в теле развивающейся особи гидробионта. Множество научных работ, появившихся в последние годы, подчеркивает важность взаимодействия целого ряда развивающихся систем в организме, однако механика развития организма как единого целого еще недостаточно исследована и не раскрыта с достаточной полнотой. Вплоть до настоящего времени большая часть научных исследований была сосредоточена на изучении биохимических процессов развития, но не уделяла достаточного внимания особенностям развития организма как целостной биологической системы [1]. Значительные усилия были затрачены учеными на изучение и выявление биохимии развития, например синтеза нуклеиновых кислот и белков, при этом причинно-следственному анализу сил, управляющих взаиморасположением клеток, уделялось неоправданно мало внимания [2]. Однако в развитии любого организма взаимодействие клеток, тканей и органов является одним из важнейших факторов: обусловленные воздействием вредных веществ, нарушения развития пагубно влияют не только на отдельные клетки, как это характерно при мутагенезе, но и на популяцию клеток. Согласованное развитие систем как у отдельных особей гидробионтов, так и в рамках биоценоза представляет собой сложнейшую цепь биологических, биохимических, физико-химических реакций, комплексное исследование и осмысление которых на сегодняшний день невозможно даже при наличии и применении передовых методов математического и компьютерного моделирования [3]. Ключевым признаком, указывающим на возможное нарушение взаимосвязей в отдельно взятом организме, могут стать морфологические изменения в органах и тканях исследуемого организма и, в перспективе, снижение темпа размножения особей в последующих поколениях. Наиболее важным в водной токсикологии оказывается изучение эмбриональных стадий онтогенеза гидробионтов, в особенности периодов морфогенетических сдвигов и изменения формообразующих регуляций. Например, у рыб отмечены характерные сдвиги с повышением чувствительности особей к токсичным соединениям на этапах гаструляции, выклева и начала работы сердца [4]. Целью настоящего исследования было проведение оценки токсичности растворов нитро-бензола и трихлорбензола с установлением максимально допустимых концентраций (МДК) для экотоксикантов, попадающих в рыбохозяйственные водоемы со стоками. Материал и методы исследований В качестве тест-объекта были взяты планктонные ракообразные Daphnia magna. Был по-ставлен ряд кратковременных опытов токсикологического характера, длительность которых составляла 48 и 96 ч. Также были проведены хронические опыты [5]. Культивация Daphnia magna проводилась по стандартным методикам [6]. Для контроля использовалась отстоянная вода объемом 200 мл, для эксперимента – вода с добавлением токсичных веществ в разной концентрации [7, 8]. В опыте была использована синхронизированная культура 1-2-дневных Daphnia magna, что позволяет исключить естественную убыль тест-объектов, т. к. длительность опыта составляла 30 сут, а продолжительность жизни Daphnia magna – 45 сут. Культивирование происходило при оптимальных температурах в диапазоне 19–21 °С, при этом особое внимание было уделено процессу стандартизации процедуры кормления и световых условий. В качестве осветительных приборов использовались приборы дневного света с реле со световым режимом 1 : 1. Опыты проводились в 3-кратной повторности. Кормление тестируемых дафний осуществлялось пекарскими дрожжами и хлореллой. В рецептуру корма входили подсушенные дрожжи, смешанные с водой из расчета 1 % дрожжей на стакан воды (тест-стакан объемом 200 мл). Эта суспензия по 3–5 капель вносилась в культуру с Daphnia magna. Хлореллу, из расчета 2 мл/л, вносили из культуры с плотностью 25–35 тыс. кл./мл. Культивирование хлореллы осуществлялось с использованием щелочной питательной среды Тамия (с содержанием мочевины, воды, фосфорнокислого калия, сернокислого магния, микроэлементов и т. д), после чего клетки отделяли от культуральной среды с помощью центрифугирования. Полученный осадок разводили некоторым количеством воды и хранили в охлажденном состоянии. Кормление хлореллой осуществлялся ежедневно, а пекарские дрожжи вносились в стаканы с тестовыми Daphnia magna 2 раза в неделю. Данные условия культивирования, при их соблюдении, гарантировали размножение Daphnia magna только партеногенезом. В рыбохозяйственные водоемы чаще всего попадают вещества различных классов опасности [6, 7], по этой причине для исследований были применены тестовые загрязняющие вещества различных классов опасности – нитробензол и трихлорбензол, – использование которых регламентируется и регулируется государством [9, 10]. Нитробензол. Органическое вещество, токсичное, с резким миндальным запахом, 4-го класса опасности. Оказывает вредное воздействие на кровяные клетки и приводит к образова-нию метгемоглобина, вызывает эффект помутнения сознания, причем эффекты воздействия могут быть отсроченными. При длительном воздействии нитробензола возможно воздействие на кроветворные органы организма, а также на печень [11]. В рамках исследования на Daphnia magna были взяты концентрации в остром опыте: 0,2; 0,1 и 0,01 мг/л. Поскольку концентрация 0,1 мг/л при сроке опыта в 96 ч дает предварительные результаты, близкие к LC50, спектр концентраций хронического эксперимента взят соответственно: 0,02; 0,01; 0,001; 0,0001 мг/л. Трихлорбензол. Компонент различных диэлектрических жидкостей. Вещество 3-го класса опасности. Вещество применяется в лакокрасочной промышленности и для получения взрывча-тых веществ, для производства красителей, гербицидов, теплоносителей, трансформаторных масел. Вызывает наркотическое состояние, довольно сильно угнетает дыхание, обладает нерезко выраженным действием раздражающего характера на слизистые оболочки зрительной системы и дыхательных путей [11]. В остром опыте, при концентрации трихлорбензола 0,1 мг/л, гибель дафний составила около 30 % от контроля. Исходя из этого наибольшая концентрация трихлорбензола для хрони-ческого опыта была выбрана равной 0,03 мг/л. Спектр концентраций для хронических опытов найден в опытах с установлением ЛК50, принят: 0,03; 0,01; 0,001; 0,0001 мг/л. Для исходного поколения и для последующих 3-х поколений Daphnia magna определялись биологические показатели. В связи с зафиксированным сдвигом между поколениями в 7 дней, для каждого поколения контроль ставился индивидуально. Достоверность разности средних определялась по критерию Стьюдента р ≥ 0,95. Результаты исследований Тестируемые бензольные соединения при их попадании в среду вызывали деструктивные нарушения биологических показателей Daphnia magna, связанные с размножением. Нитробензол. Нитробензол, как показали тесты, при концентрации, превышающей 0,1 мг/л, начинает отрицательно влиять на биообъекты (Daphnia magna) уже с первых же суток после постановки опыта. На 4-е сутки эксперимента зафиксирована гибель 40 % дафний. Отличительной особенностью действия нитробензола оказалось его влияние на поведенческие реакции дафний: за несколько часов до гибели была отмечена потеря дафниями ориентации в пространстве, характерные переворачивания через голову и опускание на дно тестовой емкости, при этом тело дафний приобретает мутный оттенок. При концентрации 0,1 мг/л не отмечено изменений по сравнению с контролем – таким образом, ее можно считать максимально допу-стимой. При изучении отсроченного воздействия нитробензола на тест-объекты были исследованы онтогенетические показатели в 3-х поколениях. Динамика развития дафний на протяжении 3-х поколений является объективным показателем, необходимым для выявления токсического воздействия нитробензола на генетическую экспрессию и генетический аппарат Daphnia magna в целом. Необходимо обратить внимание на то, что возрастная разница между поколениями со-ставила от 7 до 8 дней, что указывает на отсутствие у нитробензола токсических свойств, спо-собных затормозить овогенез и скорость созревания Daphnia magna. В хроническом опыте с максимальной концентрацией в 0,1 мг/л погибло более 60 % от общего количества тест-объектов, кроме того, необходимо отметить и повышенную гибель их эмбрионов. Данные о действии нитробензола на онтогенетические показатели у дафний пред-ставлены в табл. 1. Таблица 1 Онтогенетические показатели Daphnia magna под влиянием растворов нитробензола в хроническом эксперименте Концентрация токсиканта, мг/л Биологические показатели Выживаемость особей (за 30 сут), % Половозрелость особей, сут Первый помет, шт. Количество сброшенных карапаксов (на 10 дафний), шт. Плодовитость дафний (в пересчете на 1 самку), шт. Исходные особи Daphnia magna Контроль 94 ± 4,5 Половозрелые особи 87 ± 6,8 21,3 ± 4,1 0,0001 81 ± 15,1 91 ± 8,2 18,7 ± 2,1 0,001 92 ± 7,8 87 ± 12,3 22,5 ± 3,3 0,01 74 ± 11,4* 63 ± 12,2* 11,4 ± 1,8* 0,02 66 ± 15,3* 65 ± 7,2* 12,8 ± 2,3* I поколение Контроль 86 ± 8,2 8 10 94 ± 10,2 23,3 ± 1,8 0,0001 88 ± 11,3 8 9 91,2 ± 8,3 21,5 ± 1,6 0,001 92 ± 7,6 8 10 94 ± 11,2 23,5 ± 2,2 0,01 86 ± 12,1 8 9 90 ± 3,2 22,4 ± 2,4 0,02 75 ± 7,2* 8 9 74 ± 7,5* 21,3 ± 2,3 II поколение Контроль 95 ± 3,5 8 10 94 ± 6,2 21,2 ± 2,2 0,0001 100 8 10 87 ± 5,7 22,7 ± 1,7 0,001 85 ± 4,3 8 9 91 ± 5,8 19,5 ± 1,3 0,01 77 ± 11,2 8 9 85 ± 8,7 20,3 ± 1,4 0,02 63 ± 7,8* 8 9 75 ± 5,5* 17,5 ± 2,1* III поколение Контроль 100 8 9 100 ± 10,2 17,4± 2,3 0,0001 85 ± 10,2 8 10 99 ± 8,3 21,2 ± 1,4 0,001 99 7 10 98 ± 6,1 19,7 ± 2,5 0,01 88 ± 7,5 7 9 87 ± 8,8 16,5 ± 1,6* 0,02 77 ± 11,4* 8 9 86 ± 7,7* 11,3 ± 1,8* * Достоверная разница средних (р ≥ 0,95; tSt = 2,75; td = 2,45). Из анализа полученных в ходе эксперимента данных следует, что нитробензол макси-мально воздействует на исходное поколение Daphnia magna. Можно предположить, что у по-следующих поколений дафний вырабатывается некоторая адаптация к данному токсиканту, т. к. в последующих 3-х поколениях не зафиксировано статистически достоверной разницы между контрольной и опытной группами; в ходе эксперимента не отмечено отсроченного токсического воздействия нитробензола при концентрации 0,01 мг/л. Данная информация свидетельствует об адаптации Daphnia magna к токсическому воздействию нитробензола в процессе их развития, а концентрацию 0,01 мг/л допустимо принять за максимально допустимую. Трихлорбензол. Как следует из тестов, концентрации трихлорбензола 0,01 и 0,03 мг/л оказывают влияние на количество линек у Daphnia magna, что свидетельствует об интенсивном белковом обмене. Логично предположить, что это нарушение является онтогенетическим показателем, связанным с ростом особей. При температурах от 18–20 °С дафнии линяют 4–5 раз до периода созревания. Вместе с этим показатель линьки дафний является менее чувствительным по сравнению с прочими, например, с размножением дафний. Аналогичное явление можно отметить и в первом поколении дафний; в следующих поколениях схожее действие трихлобензола не наблюдалось. Необходимо отметить, что при концентрации трихлорбензола в 0,01 мг/л на одну особь приходилось только 0,2 эфиппия, таким образом, данную концентрацию и следует считать допустимой. Сведения о действии растворов три-хлорбензола на онтогенетические показатели Daphnia magna представлены в табл. 2. Таблица 2 Онтогенетические показатели Daphnia magna под влиянием растворов трихлорбензола в хроническом эксперименте Концентрация токсиканта, мг/л Биологические показатели Выживаемость особей (за 30 сут), % Половозрелость особей, сут Первый помет, шт. Количество сброшенных карапаксов (на 10 дафний), шт. Плодовитость дафний (в пересчете на 1 самку), шт. Исходные особи Daphnia magna Контроль 98 ± 3,2 Половозрелые особи 88 ± 7,2 22,4 ± 1,8 0,0001 85 ± 12,3 91 ± 9,5 21,7 ± 2,2 0,001 93 ± 8,2 86 ± 7,4 21,1 ± 1,6 0,01 75 ± 14,5* 58 ± 5,7* 12,4 ± 2,7* 0,03 68 ± 8,6 51 ± 8,5 13,5 ± 2,2 I поколение Контроль 94 ± 4,6 8 10 100 ± 5,5 21,5 ± 2,7 0,0001 91 ± 8,5 7 9 99 ± 8,7 22,9 ± 2,3 0,001 93 ± 5,7 7 10 97 ± 4,5 21,1 ± 1,8 0,01 87 ± 12,3 8 9 95 ± 7,3 21,4 ± 1,8 0,03 86 ± 11,2 8 8 99 ± 10,5 21,0 ± 3,3 II поколение Контроль 97 ± 2,4 7 8 82 ± 7,8 19,3 ± 2,0 0,0001 88 ± 10,2 7 10 84 ± 10,2 21,0 ± 1,6 0,001 93 ± 6,5 8 8 87 ± 9,5 21,5 ± 2,3 0,01 94 ± 4,7 7 8 82 ± 8,2 20,4 ± 2,1 0,03 92 ± 6,3 6 9 86 ± 7,3 21,2 ± 1,7 III поколение Контроль 100 9 10 100 ± 7,7 21,5 ± 2,2 0,0001 97 ± 5,5 8 11 99 ± 6,4 19,3 ± 1,5 0,001 99 8 9 97 ± 5,3 20,6 ± 1,4 0,01 90 ± 9,5 9 10 95 ± 5,8 19,8 ± 2,2 0,03 88 ± 8,2 8 10 96 ± 6,3 20,7 ± 1,2 * Достоверная разница средних (р ≥ 0,95; tSt = 2,75; td = 2,63). В качестве характерной черты действия на дафний у испытуемых токсикантов выступает токсичность в острых опытах, которая является наименьшей. Так, при концентрации 0,1 мг/л трихлорбензола гибель Daphnia magna составила 30 % тестовых особей за 98 ч, в то время как в среде с нитробензолом в качестве токсиканта гибель Daphnia magna была равной 40 % особей от тестового количества. В хроническом опыте при концентрациях трихлорбензола 0,01 мг/л гибнет от 20 до 30 % тестовых экземпляров, при концентрациях 0,001 и 0,0001 мг/л процент ги-бели практически не отличается от контроля. Аналогично ситуации с нитробензолом следующие 3 поколения дафний оказываются устойчивыми к токсическому воздействию трихлорбензола. Наибольшее воздействие трихлор-бензол оказывает не первое поколение тест-организмов; для 2-х следующих поколений Daphnia magna отклонения статистически минимальны (табл. 2). В связи с этим за максимально допу-стимую концентрацию трихлорбензола может быть принята концентрация 0,01 мг/л. Обсуждение результатов Нитробензол и трихлорбензол по своему действию на живые организмы являются ярко выраженными токсикантами, воздействуя на такие системы позвоночных животных, как крове-носная и нервная системы. Под воздействием нитробензола и трихлорбензола кровь тест-объектов может подвергаться гемолизу [12]. Исследования, проведенные лабораторным способом на млекопитающих, позволили установить лимитирующие показатели токсичности: для нитробензола ПДК 0,02 мг/л, а для трихлорбензола ПДК в питьевой воде – 0,03 мг/л. Отмечается при этом, что низшие позвоночные наименее устойчивы к воздействию хлорсодержащих соединений по сравнению с млекопитающими и птицами. Необходимо отметить повышенную чувствительность эмбриональных стадий развития организмов к токсикантам, а следовательно, и к загрязнению окружающей среды. Н. С. Строга-нов считал выживаемость объективным критерием острого отравления. Под действием малых доз токсикантов организм может быть жизнеспособен достаточно продолжительное время, но, скорее всего, у него будет нарушена репродуктивная функция либо будет происходить нарушение развития организма, с получением в дальнейшем неполноценного потомства [13]. Критерии развития и размножения гидробионтов весьма деликатные, поэтому на современном уровне развития техники и технологий их невозможно прогнозировать. Однако это позволяет сделать биологический анализ, и сегодня он положен в основу ряда прогрессивных токсикологических методик (установление МДК на каждом рыбохозяйственном объекте, предшествующее рыбохо-зяйственной ПДК) [4]. Наиболее важным инструментом в этой области, которая уже выделилась в самостоятельное направление, называемое экспериментальной тератологией, является возможность устанавливать отдаленный биологический эффект действия токсических веществ, попадающих в окружающую среду в малых концентрациях. Именно чувствительность водных организмов на стадии развития предопределила их использование в водной токсикологии в качестве биологических тестов [2]. Существующие в настоящее время биологические исследования демонстрируют высокую исследовательскую эффективность изучения эмбриональных стадий развития гидробионтов в целях установления различных критериев токсичности при загрязнении водной среды, вместе с чем открываются и новые возможности для экспресс-исследований токсичности [14]. Особенностью развития дафний является сложная многофакторная система взаимосвязей, сопровождающих их жизненно важные функции на различных этапах жизни; по взаимосвязанным реакциям и морфологическим изменениям у данных организмов, например, целесообразно судить о степени токсичности исследуемого вещества. Однако для Daphnia magna еще только предстоит исследовать многие особенности развития и размножения. Плодовитость Daphnia magna, по различным данным, колеблется от 30 до 55 особей на одну самку, размеры личинки – около 0,5 мм, личинки созревают за 3–4 дня и дают иногда до 7 пометов каждые 1–2 дня, при этом изменение плодовитости зависит не только от условий среды и кормления, но и от сезонности [13]. У Daphnia magna, по имеющимся данным, есть 2 периода резкого понижения плодовито-сти: ноябрь–январь и июнь–июль. Daphnia magna хорошо себя чувствуют и размножаются при концентрации бактерий не менее 1 млн в 1 см3 воды. Однако при численности бактерий менее 500 тыс. на 1 см3 наступление половозрелости дафний несколько задерживается; если численность бактерий ниже 200 тыс. на 1 см3, жизнь Daphnia magna становится невозможной [15]. Важнейшая особенность Daphnia magna состоит в том, что они ракообразные с высоким темпом размножения: цикл их жизни короткий, но они могут существовать при достаточно высоких плотностях. Знание же нормального развития и особенностей размножения низших ракообразных при испытании токсической активности веществ и установлении ПДК принципиально необходимы, т. к. существует еще много малоизученных аспектов, в первую очередь у Daphnia magna. Загрязнение водоемов может привести к нарушению экологического равновесия за счет гибели (резкого уменьшения) популяций гидробионтов-фильтраторов, входящих в кормовую базу различных видов рыб, может наблюдаться подавление процессов самоочищения воды [15]. Выводы Анализ развития низших ракообразных в загрязненной среде свидетельствует о том, что периоды размножения и развития у Daphnia magna являются решающими среди прочих показателей (физиологических, биохимических). Фактически весь период эмбриогенеза у дафний является достаточно уязвимым по сравнению с дальнейшими этапами развития. У дафний при действии растворов выбранных для исследования экотоксикантов в первую очередь снижается плодовитость и происходит задержка оогенеза, затем, по чувствительности, отмечается количество сброшенных карапаксов, и наименее чувствительный параметр – выживаемость взрослых особей. Усиление отдаленного токсического эффекта в трех поколениях дафний выявлено не было. Выбранный тест-объект Daphnia magna во всех наших опытах (в том числе и в хронических) показал высокую чувствительность к данным загрязнителям водной среды. За основные онтогенетические параметры в оценке качества вод предпочтительно брать такие показатели Daphnia magna, как плодовитость и нарушение процессов развития на предзародышевых стадиях. По параметру «выживаемость» нами выявлены максимально допустимые концентрации (МДК) исследуемых бензольных соединений – 0,01 мг/л. Практическое применение результатов: использование МДК для разработки эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК) для токсичных бензольных соединений, поступающих со сточными водами промышленных предприятий в окружающую среду и совершенствование методов определения допустимых концентраций токсикантов в водной среде за счет выявления их действия на наиболее чувствительные периоды онтогенеза тест-объектов.
1. Никифоров-Никишин А. Л. Морфологические особенности хрусталика гидробионтов и их применение в водной токсикологии: дис. … д-ра биол. наук. М.: Изд-во МГУТУ, 2005. 256 с.
2. Филенко О. Ф. Водная токсикология. М.: Изд-во МГУ, 1988. 154 с.
3. Аптер М. Кибернетика и развитие. М.: Мир, 1970. 216 с.
4. Строганов Н. С., Путинцев А. И., Исакова Е. Ф., Шигин В. И. Метод токсикологического контроля сточных вод // Биол. науки. 1979. № 2. С. 90–96.
5. Методические рекомендации по биотестированию природных, сточных вод и отдельных загрязняющих веществ. М.: Изд-во ВНИРО, 1982. 33 с.
6. Об утверждении Методических указаний по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения: Приказ Федерального агентства по рыболовству от 04 августа 2009 г. № 695 (с изм. от 22 декабря 2016 г.). URL: http://docs.cntd.ru/document/902172637 (дата обращения: 12.09.2020).
7. РД 52.24.669-2005. Унифицированные методы биотестирования для обнаружения токсического загрязнения поверхностных вод суши с использованием микрозоопланктона. М.: ГУ ЦКБ ГМП, 2005. 28 с.
8. Авилова Г. А., Карпухина Е. А. Бензол. М.: Центр ГКНТ, 1985. 45 с.
9. Об утверждении нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов ПДК вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения: Приказ Минсельхоза России от 13 декабря 2016 г. № 552 (с изм. от с 27 июня 2020 г.). URL: http://docs.cntd.ru/document/420389120 (дата обращения: 13.09.2020).
10. Большая энциклопедия нефти и газа. URL: https://ngpedia.ru/id450175p1.html (дата обращения: 13.09.2020).
11. Кипер Р. А. Свойства веществ: справ. Хабаровск: Изд-во Дальневосточ. гос. гуманит. ун-та, 2009. 387 с.
12. Канцерогенные вещества: справ. М.: Медицина, 1986. 332 с.
13. Сотников Ф. И. Критические периоды в раннем онтогенезе гидробионтов и их роль в биотестировании и эколого-рыбохозяйственном нормировании: дис. … канд. биол. наук. М.: Изд-во МГУТУ, 2005. 148 с.
14. Филенко О. Ф. Опыт применения модельных водных экосистем для решения исследовательских задач // Биологические процессы загрязненных модельных водоемов. М.: Изд-во МГУ, 1984. С. 174–192.
15. Артюхова В. И., Дмитриева А. Г. и др. Мониторинг вод рек Подмосковья методами биотестирования // Водные ресурсы. 1991. № 1. С. 115–121.
