Введение
В настоящее время известно 52 вида вирусов, поражающих картофель [1]. В Российской Федерации (далее – РФ) пять наиболее опасных видов: вирус картофеля Y (PVY), вирус картофеля X (PVX), вирус скручивания листьев (PLRV) и вироид веретеновидности клубней (PSTVd). Менее опасными, но при этом увеличивающими потери урожая при совместном заражении с другими вирусами, являются вирусы картофеля М и S (PVM и PVS соответственно) [2].
Вирус картофеля Y вызывает серьезные потери урожая картофеля (до 30 % и более в зависимости от времени воздействия, типа вируса, устойчивости сорта растения-хозяина), причем он поражает не только картофель, но и другие сельскохозяйственные культуры как в РФ, так и в других регионах планеты. Все эти факторы делают вирус картофеля Y экономически важным фитопатогеном [3, 4].
Вирус картофеля Y относится к роду Potyvirus, семейству Potiviridae. Вирусные частицы нитевидные, размер составляет 730×11 нм, осаждаются как единый компонент с коэффициентом седиментации около 150S [5]. Геном представлен одноцепочечной позитивной молекулой РНК, длина которой составляет 9.7 тыс. нуклеотидов, 5’-конец РНК ковалентно соединен 5’-концевым терминальным белком (Vpg), на 3’-конце располагается полиА-тракт [6]. Молекула РНК содержит 10 открытых рамок считывания, транслируемых одним полибелком [7].
Вирус картофеля Y передается при контакте поврежденных клубней, а также через семена. Другим агентом распространения вируса являются тли [8].
Симптомы заражения вирусом картофеля Y вариабельные и зависят от таких факторов, как штамм вируса, сорт и условия выращивания растения-хозяина. Может развиваться резкий некроз вдоль жилок, вплоть до полного отмирания листьев. Некроз может быть мозаичным, и сопровождаться морщинистостью листьев, которая может проявляться и без некротических изменений [9].
Множественность путей распространения вируса, вариабельность симптомов выявляют необходимость разработки достаточно быстрого, точного, чувствительного метода для выявления вируса как в организме растения-хозяина, так и в организмах переносчиков.
В настоящее время обычно используется метод иммуноферментного анализа (далее – ИФА) – это высокоточный и высокочувствительный метод, но он достаточно дорог, и для него может быть использован только свежий материал [10]. Второй метод, активно используемый для выявления возбудителей заболеваний, – метод ПЦР, но его классический вариант нельзя применять, так как матрицей для ПЦР является молекула ДНК, а вирус картофеля Y (PVY) РНК-содержащий. Но существует модификация метода ПЦР – обратная транскрипция ПЦР (далее – ОТ-ПЦР), которая позволяет выявлять РНК различных возбудителей [там же]. Метод ОТ-ПЦР по себестоимости сопоставим с иммуноферментным анализом, но позволяет работать не только со свежим, но и фиксированным материалом.
Цель данной работы – разработка ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y в растительном материале. Разработка включает в себя подбор структуры праймеров, условий реакции ОТ-ПЦР, анализ размера амплифицируемого фрагмента, воспроизведение ОТ-ПЦР на растительном материале, определение нуклеотидной последовательности полученного фрагмента, что является подтверждением того факта, что данная ПЦР-тест система выявляет именно наличие РНК вируса картофеля Y.
Материалы и методы
Последовательности геномов вируса картофеля Y (PVY) были скопированы из базы данных Genome, Nucleotide (www.ncbi.nlm.nih.gov). Названия последовательностей и их паспортные номера представлены в табл. 1.
Данные последовательности были проанализированы в программе AliBee - Multiple alignment Release 3.0 на сайте http://www.genebee.msu.su/genebee.html. В выявленных консервативных участках отбирали фрагменты 20–25 нуклеотидов, начинающиеся и заканчивающиеся на гуанин или цитозин (предполагаемые праймеры, представленные в табл. 2). Далее для праймеров проводился расчет температуры отжига по формуле:
Тотжига = (2×(количество аденина + тимина) +
4×(количество гуанина + циозина)) – 5 . (1)
Также в программе Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) проверялась уникальность праймеров и присваивался номер от 0 – последовательность не выявляется в нужных видах и генах, до 10 – последовательность выявляется только в геноме вируса и больше нигде.
Из табл. 1 были выбраны два уникальных праймера (уровень уникальности – от 8 и выше) с одинаковыми температурами отжига (допускаются различия температуры отжига до 2 оС), которые были синтезированы в фирме Синтол.
В качестве источника нуклеиновых кислот использовались пазушные почки клубня картофеля и покровная ткань вокруг них. Суммарные нуклеиновые кислоты выделялись с помощью модификации гуанидин-изотиоцианатного метода [11].
Реакцию обратной транскрипции проводили следующим образом: 50 нг РНК растворяли в 4 мкл воды, добавляли по 1 мкл обратного праймера в концентрации 40 рМ/мкл, прогревали при 95 оС 5 мин, затем добавляли 1 мкл 10Х буфера для обратной транскрипции, 1 мкл смеси dNTPs (концентрация 4 мкМ), 1 мкл обратной транскриптазы MMLV (15 е.а./мкл) (Сибэнзим) и деионизированную воду до 10 мкл. Полученную смесь инкубировали при 37 оС 1 ч 10 мин. Затем переосаждали и вносили на реакцию ПЦР: 2 мкл раствора матрицы после обратной транскрипции, 1 мкл буфера для ПЦР с 1.5 мМ MgCl2, 0.5 мкл смеси dNTPs (концентрация 4 мкМ), по 1 мкл праймеров, концентрация каждого 10 рМ/мкл, 0.75 мкл Taq-полимеразы (5 ед.а./мкл) (Сибэнзим) и деионизированную воду до 10 мкл. Реакция пцр состоит из трех этапов 1-й и 3-й состоят из одного цикла, так как не требуется циклическое изменение температуры. Продукты реакции амплификации разделяли в 6 %-ной нативном полиакриламидном геле, который окрашивался бромистым этидием [там же].
ПЦР-продукты экстрагировали из геля [там же] и определяли нуклеотидную последовательность в фирме Евроген. Полученные результаты сравнивали в программе Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) с уже имеющимися в них последовательностями генома различных изолятов вируса картофеля Y.
Результаты и их обсуждение
Вирус картофеля Y имеет белковый капсид, протеомеры которого могут быть использованы для детекции вируса в растительных тканях методом иммуноферментного анализа, однако этот метод достаточно дорог. Метод ПЦР дешевле, при этом имеет сопоставимые чувствительность и точность. Но геном вируса представлен молекулой РНК. Данная молекула не может быть матрицей для стандартного метода ПЦР. Поэтому был выбран метод обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией.
Для выявления РНК вируса PVY необходимо разработать праймеры. Для этого в базе данных (www.ncbi.nlm.nih.gov) было выбрано 16 последовательностей полных геномов различных изолятов вируса картофеля Y. Последовательности полных геномов использовали для большей простоты выравнивания и получения максимального количества фрагментов последовательности РНК вируса, которые можно было бы использовать в качестве праймеров.
Названия изолятов и их номера в базе данных представлены в табл. 1.
Так как геном вируса представляет собой мРНК (+ цепь РНК), кодирующую один полибелок, который транслируется, а затем разрезается на отдельные субъединицы, выбор открытых рамок считывания, кодирующих отдельный белок, не производился, а анализу подвергались нуклеотидные последовательности всего генома.
Далее последовательности были проанализированы в программе AliBee - Multiple alignment Release 3.0 на сайте http://www.genebee.msu.su/genebee.html. В результате сравнения последовательностей выявлены идентичные у всех исследованных изолятов участки геномов, в которых выбирали последовательности для будущих праймеров. Последовательности для праймеров должны быть длиной 20–25 нуклеотидов, начинаться и заканчиваться на гуанин или цитозин.
Затем с помощью формулы (1) были рассчитаны температуры отжига, а также посчитано количество нуклеотидов во всех фрагментах. Далее в программе Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) проверяли уникальность праймеров. Для этого сравнивали исследуемую последовательность с уже имеющимися в базе. В зависимости от уникальности исследуемым последовательностям присваивалось значение уникальности от 10 (обнаруживается только в геномах различных изолятов вируса картофеля Y) до 0 (не обнаруживается в геномах PVY, но выявляется в геномах других организмов).
Последовательности и их положение в геноме, температура отжига, количество нуклеотидов и его уникальность представлены в табл. 2.
Наибольшей степенью уникальности обладают фрагменты под №№ 28 (уникальность – 9), 31 и 37 (уникальность – 8.5), но у фрагмента № 28 температура отжига составила 57 °С. Фрагменты №№ 31 и 37 имеют одинаковую температуру отжига (56 °С). Поскольку в температурах отжига допускается различие до 2 °С, все три фрагмента могут быть использованы в качестве праймеров, но также необходимо учитывать размер ПЦР-продукта. Оптимальным для разделения с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле являются фрагменты ДНК длиной от 150 до 300 пар нуклеотидов. Фрагменты №№ 28 и 31 будут образовывать ПЦР-продукт длиной 158 пар нуклеотидов, такая длина ближе к нижней границе оптимума. Пары фрагментов №№ 28/37 и №№ 31/37 будут образовывать фрагменты длиной 451 и 313 пар нуклеотидов. Соответственно, такие фрагменты длиннее оптимальных.
Поэтому были рассмотрены фрагменты с №№ 32 по 36, их уникальность составила 8. По температуре отжига совпал фрагмент № 33, у остальных температура отжига не совпадает больше допустимых различий. Определение длины ПЦР-продукта показало, что для пары №№ 33 и 37 она будет составлять 271 пару нуклеотидов, которая попадает в пределы оптимальных длин фрагмента.
Следует отметить, что фрагмент № 4 (уникальность – 9) не рассматривался в связи с далеким расположением от фрагмента № 28, с вероятностью не получить ампликон обычными методами и низкой уникальностью соседнерасположенных фрагментов.
Таким образом, последовательности №№ 33 и 37 были использованы для создания праймеров.
Название и последовательность, температура отжига праймеров представлены в табл. 3, а также предполагаемый размер ПЦР-продукта, рассчитанный по последовательности генома вируса.
Праймеры после обработки были заказаны в фирме Синтол. Далее проводилась проверка работы праймеров в реальных условиях. Для анализа использованы образцы пазушных почек клубней картофеля, так как растущие ткани более пригодны для выделения нуклеиновых кислот как ткани с меньшим размером клеточных стенок и большим объемом генетического материала. Клубни были предоставлены с фермерского поля в Куменском районе Кировской области.
Выбрано восемь клубней с прорастающими пазушными почками, из которых брался материал для обратной транскрипции и ПЦР. Продукты реакции визуализировали методом электрофореза в нативном полиакриламидном геле. Полученный результат представлен на рис. 1.
Как видно из результатов гель-электрофореза, положительный результат выявлен в образце № 1. В дорожке 1 видна единственная четкая полоса чуть ниже полосы маркера длиной 300 пар нуклеотидов. Также слабо светящаяся полоса на том же уровне присутствует в дорожке 6 (образец картофеля № 6). Наличие полос означает, что праймеры провзаимодействовали с матрицей, а размер полученного фрагмента ДНК соответствует ожидаемому. Эти факты позволяют предполагать, что в образцах картофеля №№ 1 и 6 присутствует РНК вируса PVY. Тогда как в других образцах вирус отсутствует. Отсутствие дополнительных полос на дорожках 1 и 6 указывает на то, что праймеры отжигаются только на одном участке в образце нуклеиновых кислот, что подтверждает высокую степень уникальности, которая была определена теоретически. Отсутствие одинаковых полос во всех образцах подтверждает отсутствие реакции праймеров с РНК хозяина, а также их уникальность.
Кроме того, задачей являлась оценка возможности использовать данные праймеры в существующих условиях реакции ПЦР для выявления вируса картофеля Y.
Так как положительный контроль – образец ткани картофеля, зараженного вирусом Y, отсутствовал, проверку того, что данный амплифицированный фрагмент и есть ДНК-копия генома вируса картофеля Y, проводили, определяя нуклеотидную последовательность полученного ПЦР-продукта.
Образец РНК № 1 использовали для получения ПЦР-продукта, который был очищен и отправлен на определение нуклеотидной последовательности в фирму Евроген.
Получена следующая последовательность нуклеотидов: TGGCATTCTCATTTTGGACGTGATAGCTAAGCCTAAATATGCAATGCAGGGATATTTACAATTTTTTATAAAAACACCCAGACCAAAACAAGTATCAACAGTCTGCTTCCTCCTGCATCGATTGTGTCA.
Она короче, чем размер ПЦР-продукта, так как секвенирование ПЦР-продуктов затруднено, поэтому в текстовый редактор переведен только тот участок, в котором были наиболее точные результаты капиллярного гель-электрофореза.
Полученная последовательность проанализирована в Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov). Результаты представлены на рис. 2.
Как видно из результатов сравнения последовательности с последовательностями из базы данных генов в Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov), исследуемая последовательность на 100 % совпадает с последовательностью генома вируса картофеля Y (PVY). Соответственно, данная пара праймеров в выбранных условиях обеспечивает амплификацию с матрицы РНК PVY и может быть использована как пара праймеров для ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y.
Данная система апробирована с использованием материалов, предоставленных Институтом агробиотехнологий ФИЦ Коми НЦ УрО РАН (Республика Коми, г. Сыктывкар). Проанализировано 48 клубней картофеля по окончании периода зимней лежкости в хранилище Института. Клубни отобраны от 16 селекционных сортообразцов питомников предварительного, основного и конкурсного испытаний по три клубня от каждого номера. В данном случае повторность не учитывалась, так как клубни были выкопаны с разных участков полей и не могли быть перезаражены через насекомых или какие-либо микромеханические повреждения. Поэтому можно было анализировать клубни как отдельных представителей, возможно, зараженные патогеном. Из 48 образцов зараженными оказались восемь, т.е. процент общей зараженности составил 16.7 %. Только в одном сортообразце отмечено заражение двух клубней из трех, в остальных же случаях заражен был только один клубень из трех. Можно предположить, что, с одной стороны, это показывает, что механические микроповреждения, получаемые клубнями в ходе уборки копателем и контактом с его рабочим органом, обеспечивают непосредственно перенос патогена, так как сами клубни не контактировали и находились на разных участках полей, а с другой – заражение произошло в ходе контакта уже непосредственно во время закладки в лечебный период и при последующем зимнем хранении. Таким образом, данная аналитическая система требует дальнейшей проверки с подбором материала.
Заключение
Разработана ПЦР-тест система для выявления генетического материала вируса картофеля Y. По результату анализа генома подобраны праймеры, апробированные в условиях реакции. Таким образом, праймеры PVY 1 F и PVY 1 R готовы для разработки тест-системы для выявления материала вируса PVY. Так же были подобраны условия реакции, и за счет определения нуклеотидной последовательности подтверждена достоверность реакции.
