Динамика увеличения антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов растет ежедневно, хотя за последние несколько десятилетий новых молекул антибиотиков разработано не было. Большие убытки в связи с этим несет животноводство. Одним из решений проблемы антибиотикорезистентности бактерий может быть улучшение уже существующих антимикробных препаратов посредством инкапсулирования действующего вещества в наноконтейнеры. Цель исследования – получение липосомальной формы левофлоксацина и оценка ее эффективности в отношении Listeria monocytogenes. В ходе работы рассмотрены подходы к созданию липосом как структурам, доставляющим антибиотики к месту действия. Пустые липосомы получали конвекционным методом. Для уменьшения размера липосом была использована обработка в ультразвуковой бане при температуре 20±2 °С и частоте звука 35 кГц. Включение левофлоксацина в липосомы проведено методом активной загрузки, созданием градиента концентрации сульфата аммония. Левофлоксацин растворяли в 1 % растворе уксусной кислоты, после чего инкубировали с ранее подготовленными липосомами. Были получены липосомы левофлоксацина с концентрацией 1 мг/мл и проведена оценка эффективности липосомального левофлоксацина в сравнении с обычной формой антибиотика и липосомами, не нагруженными антибиотиком по отношению к клеткам Listeria monocytogenes. Для оценки эффективности антибактериального эффекта была произведена совместная инкубация бактериальной суспензии микроорганизмов Listeria monocytogenes 766 в LMX Broth в течение 24 ч при 37 °С. Показано, что эффективность липосомальной формы отличается от классической. Снижение жизнеспособно-сти тест-объекта при использовании нанокапсулированного левофлоксацина составляет 27,5 % в сравнении с использованием классического левофлоксацина. Липосомы без антибиотика не проявляли антибактериального эффекта вообще.
антибиотики, антибиотикорезистентность, липосомы, липосомальная форма, наноконтейне-ры
Введение. Бактериальные инфекции были и остаются одной из важнейших современных проблем, уносят жизни и причиняют огромный экономический ущерб в совершенно разных областях экономики [1–4]. Активно используемые на сегодняшний день антимикробные препараты, из-за нерационального использования и приобретения микроорганизмами резистентности к ним, уже не являются столь эффективными, а дальнейшие прогнозы ученых пугают [5, 6].
Одним из наиболее спорных направлений использования антибиотиков является животноводство. Да, безусловно, в условиях до сих пор не решенной проблемы мирового голода, дефицита белка, увеличения потребности в продукции на фоне продолжающейся эпидемии COVID-19 и тяжелых геополитических обстоятельствах невозможно говорить об отказе от антимикробных препаратов или сокращении применения их в животноводстве, однако в странах Европы на сегодняшний день реализуются направленные на это стратегии [7, 8].
Также необходимо отметить, что увеличение темпов производства неизбежно влечет за собой и увеличение контрафактной продукции, а именно – остаточное количество антибиотиков в продукции животного происхождения [9]. В ветеринарно-санитарных правилах установлены сроки, при которых животному перестают давать антибиотики в лечебных или профилактических целях перед убоем, однако на практике нередко ветеринарные врачи, боясь экономических потерь, данные сроки не соблюдают [10]. Результатом этого является наличие в готовом продукте остаточных количеств антибиотиков и дальнейшее накопление их в организме человека [11].
Для решения данных проблем возможно использование стратегии повышения эффективности антимикробных препаратов [12]. Одним из перспективных направлений по данной теме является инкапсулирование биологически активных веществ в наноразмерные контейнеры. Из большого разнообразия наноконтейнеров, которые рассматриваются в качестве переносчиков антибиотиков, особо выделяются на текущий момент липосомы [13].
Липосомы – однослойные или многослойные липидные визикулы, содержащие в своем внутреннем слое водное ядро. Строение липосомы позволяет включать в ее состав различные биологически активные вещества, что открывает широкие перспективы и позволяет добиться ряда преимуществ:
• снижение для организма токсичности многих препаратов позволяет использовать препараты с низким терапевтическим индексом;
• включение в липосомы препаратов повышает их защиту от инактивирующих их агентов;
• липосомы биосовместимы с клетками организма, так как основным компонентом для их создания являются природные фосфолипиды. Они не являются токсичными для организма, легко биодеградируемы, не вызывают иммунных реакций [14].
Также необходимо отметить, что липосомы возможно модифицировать для достижения желаемых функций, например покрытие липосом оболочкой из полиэтиленгликоля позволяет повысить устойчивость и предотвратить неспецифическое всасывание, а установление на поверхности липосомы специфического лиганда дает возможность осуществления направленного транспорта к клеткам-мишеням [13–15].
Цель исследований – разработка и получение липосомальной формы левофлоксацина и оценка ее эффективности в отношении Listeria monocytogenes.
Задачи: создание липосом и липосомальной формы левофлоксацина; исследование эффективности липосомальной формы левофлоксацина в отношении Listeria monocytogenes.
Материалы и методы. Для создания липосомальной формы левофлоксацина в исследовании использовались следующие материалы: соевый лецитин (Lecigran M, Россия), холестерин (PanReac Applichem, США), левофлоксацин (Millipore, Sigma-Aldrich, Supelco, США), сульфат аммония (Merk, Германия), хлороформ ХЧ (Компонент-реактив, Россия), физиологический раствор, уксусная кислота (PanReac Applichem, США).
Получение липосом с включенным антибиотиком проходило в несколько стадий. На первой стадии получали пустые липосомы конвекционным методом. Лецитин и холестерин с соотношении 7:3 помещали в круглодонную колбу и растворяли в хлороформе. Далее колбу помещали в роторный испаритель RV10 digital V (IKA, Германия) и отгоняли хлороформ под вакуумом при температуре 37 °С и скорости вращения 90 об/мин, до полного удаления хлороформа в колбе. Образовавшуюся липидную пленку регидратировали 0,3 М раствором сульфата аммония до концентрации липидов 1 мг/мл, в результате была получена суспензия липосом различного размера и строения (рис. 1). Для отделения не включившегося в липосомы сульфата аммония использовался метод диализного мешка.
Рис. 1. Полученная суспензия «пустых» липосом разного размера и строения (×10)
Включение левофлоксацина в липосомы было проведено методом активной загрузки, созданием градиента концентрации сульфата аммония. Левофлоксацин растворяли в 1 % р-ре уксусной кислоты, после чего инкубировали с ранее подготовленными липосомами в течение 20 мин при температуре 50 °С на водяной бане ПЭ-4312 (Экохим, Россия) [16].
Количественная оценка микроорганизмов проводилась c помощью автоматического анализатора Tempo (bioMerieux,Франция) и коммерческого набора для оценки общей микрофлоры Tempo AC (bioMerieux,Франция). Исследования проводились в 5-кратной повторности. Рассчитывали среднее арифметическое значение, среднеквадратичное отклонение результатов и доверительный интервал при вероятности ɑ = 0,95.
Результаты и их обсуждение. Одним из наиболее важных свойств липосом является их размер [17]. Для уменьшения размера липосом была использована обработка в ультразвуковой бане Elmasonic S 150 (ELMA, Швейцария) при температуре 20±2 °С и частоте звука 35 кГц. Как известно, увеличение дисперсности липосом сопровождается увеличением оптической плотности. Время воздействия ультразвука определяли экспериментально. Замеры оптической плотности проводили на спектрофотометре UNICO 2800 (UNICO, США) при длине волны 640 нм и толщине слоя 10 мм. Обработку ультразвуком проводили до тех пор, пока оптическая плотность суспензии не переставала изменяться, что свидетельствует о достижении максимально возможной дисперсности системы при используемых технологических параметрах, результаты представлены на рисунке 2.
Рис. 2. Зависимость оптической плотности (А) от продолжительности
ультразвуковой обработки
Для определения количества левофолоксацина, которое возможно включить в липосомы при используемом соотношении липидов, был проведен ряд опытов с различной концентрацией антибиотика.
После инкубации 1 мл опытной суспензии фильтровали через нейлоновые фильтрующие насадки c диаметром пор 0,2 мкм Millipore (Merk, Германия). Фильтрат исследовали на наличие антибиотиков группы хинолонов методом мультиплексного иммунно-ферментного анализа на полуавтоматическом анализаторе Randox Envestigator (Randox, Великобритания).
При концентрации 1 мг/мл наблюдается наличие антибиотиков хинолоной группы, что свидетельствует о максимально возможном пределе включения левофлоксацина в липосомы.
Для оценки эффективности антибактериального эффекта была произведена совместная инкубация бактериальной суспензии микроорганизмов Listeria monocytogenes 766 в LMX Broth (bioMeriux, Франция) в течение 24 ч при 37 °C. Исходное количество микроорганизмов в суспензии составляло 105 КОЕ/мл, с классической формой антибиотика, полученной липосомальной суспензией с антибиотиком и липосомальной суспензией без антибиотика. Поскольку минимальная подавляющая концентрация левофлоксацина в отношении Listeria monocytogenes составляет 1–2 мг/л, липосомальная суспензия с антибиотиком была разведена до концентрации 2 мкг/мл [18]. Полученные результаты представлены в таблице. Контрольный образец представляет собой питательную среду без добавлений, поскольку минимальный предел обнаружения прибора составляет 100 КОЕ/мл, то есть значение менее 100 интерпретируется как стерильный образец.
Количественная оценка микроорганизмов Listeria monocytogenes после инкубации
с классической формой антибиотика, липосомальной формой антибиотика
и пустыми липосомами, КОЕ/мл
|
Показатель |
Значение |
|
Липосомальная суспензия с левофлоксацином |
3,72 · 106 ± 0,78 · 106 |
|
Классический левофлоксацин |
5,1 · 106 ± 0,78 · 106 |
|
«Пустые» липосомы |
Более 1,0 ·108 ± 0,78 · 106 |
|
Суспензия микроорганизмов без добавления левофлоксацина |
Более 1,0 · 108 ± 0,78 · 108 |
|
Контроль |
Менее 100 |
Заключение. В ходе работы были получены липосомы левофлоксацина с концентрацией 1 мг/мл и проведена лабораторная оценка эффективности липосомального левофлоксацина в сравнении с обычной формой антибиотика и липосомами, не нагруженными антибиотиком. По результатам исследования можно заключить, что по эффективности липосомальная форма незначительно отличается от классической. Зафиксировано снижение числа жизнеспособных клеток на 27,5 %. Кроме этого, как показывают данные литературы, одним из главных преимуществ липосомальной формы лекарств является долгая элиминация из организма, следовательно, для более информативной и корректной оценки эффективности необходимо провести дальнейшие исследования с использованием макроорганизмов. Липосомы без антибиотика не проявляли антибактериального эффекта.
1. Видовой состав и оценка производственных потерь при субклинических маститах коров в хо-зяйствах Костанайской области (Казахстан) / Г.Д. Чужебаева [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2021. № 11. С. 116–122.
2. Disability weights for the Global Burden of Disease 2013 study / J.A. Salomon [et al.] // Lancet Glob Health. 2015. № 1. Р. 712–723.
3. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федера-ции в 2020 году: государственный доклад / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. М., 2021. 256 с.
4. Михеева М.А., Михеева И.В. Динамика рейтинга экономического ущерба от инфекционных бо-лезней как критерий эффективности эпидемиологического контроля // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020. № 2. С. 174–181.
5. Намазова-Баранова Л.С., Баранов А.А. Антибиотикорезистентность в современном мире // Педиатрическая фармакология. 2017. № 14 (5). С. 341–354.
6. Оценка риска появления резистентности к антибиотикам условно-патогенной и патогенной микрофлоры, выделяемой из продуктов животного происхождения / А.М. Мендыбаева [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2022. № 2. С. 147–156. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2022-2-147-156.
7. Щепеткина С.В. Антибиотики в птицеводстве: запретить нельзя нормировать // Эффективное животноводство. 2019. № 4 (152). С. 80–84.
8. Ветвицкая А. Мифы и реальность замены антибиотиков в птицеводстве // Эффективное жи-вотноводство. 2020. № 7 (164). С. 52–57.
9. Батаева Д.С., Зайко Е.В. Риски, связанные с наличием в мясе и в продуктах убоя животных остаточных количеств антимикробных препаратов // Теория и практика переработки мяса. 2016. № 3. С. 4–12.
10. Детекция патогенных микроорганизмов рода LISTERIA методом полимеразной цепной реакции в реальном времени / Е.В. Соколова [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2020. № 12. С. 117–125.
11. Заугольникова М.А., Вистовская В.П. Изучение контаминации животноводческой продукции остаточными количествами антибиотиков // Acta Biologica Sibirica. 2016. № 3. С. 9–20.
12. Эффективность применения липосомальных форм антибиотиков при лечении некоторых ин-фекционных заболеваний в эксперименте / Г.К. Исмаилова [и др.] // Вестник ВолГМУ. 2007. № 1 (21). С. 69–72.
13. Липосомы как система таргетной доставки лекарственных средств (обзор) / В.С. Горбик [и др.] // Российский биотерапевтический журнал. 2021. № 1. С. 33–41.
14. Толчева Е.В., Оборотова Н.А. Липосомы как транспортное средство для доставки биологиче-ски активных молекул // Российский биотерапевтический журнал. 2006. № 1. С. 54–61.
15. Пат. 2014112220. Российская Федерация МПК A61K 39/39. Пегтлированные липосомы для до-ставки кодирующей иммуноген РНК / Джилл Эндрю, Верма Аюш; заявитель и патентооблада-тель Новартис А.Г. № 2014112220/10; заявл. 31.08.2012; опубл. 07.03.2013, Бюл. № 28.
16. Создание и изучение свойств липосомальной формы левофлоксацина / Г.М. Сорокоумова [и др.] // Тонкие химические технологии. 2013. № 8 (5). C. 72–76.
17. Характеристика и оценка стабильности липосомальных препаратов / М.В. Дмитриева [и др.] // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2018. № 3. С. 36–44.
18. Падейская Е.Н. Фармакокинетика левофлоксацина как основа режима дозирования и оптими-зации схем лечения // Фармакокинетика и фармакодинамика. 2005. № 2. С. 58–71.
