Введение. Одними из наиболее востребованных ферментов микробного происхождения, применяемых в пищевой и перерабатывающей промышленности, а также в сельском хозяйстве, являются амилазы, на долю которых приходится около 25 % мирового рынка ферментов. Микробные амилазы применяют для конверсии крахмала в олигосахариды и в глюкозу в бродильных и крахмало-паточных производствах, для отбеливания сырья в бумажном и текстильном производствах, в качестве биодобавок к моющим средствам, а также в качестве добавок в крахмалсодержащие корма в птицеводстве и животноводстве для повышения их усвояемости [1–3].
Несмотря на обилие амилолитических штаммов, применяемых в промышленности, постоянно идет поиск новых, в т. ч. нетрадиционных продуцентов микробных амилаз. В качестве одного из перспективных продуцентов амилолитических ферментов рассматриваются грибы р. Alternaria [4–6]. Другим перспективным продуцентом, позволяющим осуществлять процесс при пониженной температуре, являются выделенные из пещер низкотемпературные амилолитические штаммы Geomyces pannorum [7, 8].
Использование штаммов в биотехнологических процессах невозможно без сохранения их исходных вариантов в микробиологических коллекциях. Общепризнанным, наиболее надежным способом такого сохранения считается их сублимационное высушивание из замороженного состояния (лиофилизация) [9, 10]. Главной проблемой при лиофилизации является возможная гибель микробных клеток в процессе замораживания и высушивания. Для решения этой проблемы используют разнообразные эмпирически подбираемые защитные среды, повышающие долю выживших при лиофилизации клеток [11].
Цель исследований – изучение возможности лиофилизации выделенных авторами в ходе предыдущих исследований амилолитических штаммов Alternaria tenuissima К22 и Geomyces pannorum ВКМ F-4777D.
Задачи: проверка возможности сохранения жизнеспособности штаммов при лиофилизации без использования защитных сред, с использованием стандартных защитных сред; выбор защитной среды, обеспечивающей максимальное сохранение жизнеспособности исследуемых штаммов при лиофилизации.
Объекты и методы. Объектами исследования служили выделенные авторами штаммы Alternaria tenuissima К22 и Geomyces pannorum ВКМ F-4777D. Штамм Alternaria tenuissima К22 выделен из инфицированного зерна яровой пшеницы, штамм G. pannorum ВКМ F-4777D выделен из грунта карстовой пещеры Караульная-2 и запатентован в качестве низкотемпературного продуцента амилазы [12]. Оба штамма характеризуются высокой амилолитической активностью (рис. 1).
Конидии изучаемых штаммов суспендировали в одной из защитных сред, после чего лиофилизировали в лиофильной сушилке Bio-Rus-4SFD в следующем режиме: замораживание при –36 °C в течение 5 ч; основная сушка при –40 °C в течение 15 ч при давлении 60 Па; вторичная сушка с шагом от 5 °C до 15 °C при давлении 80 Па в течение 5 ч [13, 14].
Рис. 1. Амилолитическая активность изучаемых штаммов: 1 – A. tenuissima К22; 2 – G. pannorum ВКМ F-4777D
В качестве защитных сред использовали сахарозо-желатиновый агар (среду Файбича) [15, 16], среду Файбича с 1 % аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта [17] и разработанную авторами пептон-сахарозо-глицериновую среду следующего состава: пептон ферментативный сухой – 3,2 г; сахароза – 10 г; глицерин – 10 мл; вода дистиллированная – 90 мл. Контролем служили конидии, суспендированные в дистиллированной воде без добавления лиопротекторов.
Жизнеспособность конидий после лиофилизации определяли прямым методом по их способности к прорастанию на агаризованной питательной среде (рис. 2).
Долю выживших конидий определяли как отношение числа конидий, сформировавших проростковые гифы, к общему числу конидий. Среднее число конидий, просмотренных в каждом варианте на предмет наличия проростковых гиф, составило 168 шт. для A. tenuissima К22 и 282 шт. для G. pannorum ВКМ F-4777D.
Рис. 2. Примеры непроросших (1) и проросших (2) конидий изучаемых штаммов: верхние
фотографии – A. tenuissima К22; нижние фотографии – G. pannorum ВКМ F-4777D
Статистическую значимость различий между контрольным вариантом и вариантами с защитными средами по доле проросших конидий проверяли точным тестом Фишера для таблиц 2 × 2 с использованием GraphPad QuickCalcs в качестве программного обеспечения.
Результаты и их обсуждение. Выживаемость конидий A. tenuissima К22 в контроле (без использования защитной среды) составила 75,9 %. Использование защитной среды Файбича и пептон-сахарозо-глицериновой среды не привело к статистически значимому изменению доли выживших конидий, которая составила 76,4 % для среды Файбича и 77,1 % для пептон-сахарозо-глицериновой среды. Введение аскорбиновой кислоты в среду Файбича привело к статистически значимому (p < 0,001) снижению доли выживших конидий до 7,2 % (рис. 3).
Выживаемость конидий G. pannorum ВКМ F-4777D в контроле (без использования защитной среды) составила 82,0 %. Использование защитной среды Файбича привело к статистически значимому (p < 0,001) увеличению доли выживших конидий до 95,3 %. Пептон-сахарозо-глицериновая среда также статистически значимо (p < 0,05) увеличила долю выживших конидий до 88,1 %. Как и в случае с A. tenuissima К22, введение аскорбиновой кислоты в среду Файбича привело к статистически значимому (p < 0,001) снижению доли выживших конидий G. pannorum ВКМ F-4777D (до 44,4 %) (рис. 4).
Рис. 3. Прорастание лиофилизированных конидий A. tenuissima К22
в разных вариантах эксперимента
Рис. 4. Прорастание лиофилизированных конидий G. pannorum ВКМ F-4777D
в разных вариантах эксперимента
В целом по эксперименту выживаемость конидий G. pannorum при лиофилизации во всех вариантах, за исключением контроля, была статистически значимо (p < 0,001) выше, чем выживаемость конидий A. tenuissima (табл.).
Различия между прорастанием конидий A. tenuissima К22 и G. pannorum ВКМ F-4777D
в разных вариантах эксперимента
|
Вариант защитной среды |
Различие |
Статистическая значимость различий |
||
|
раз |
процентных пунктов |
p двустороннее |
p одностороннее |
|
|
Контроль без лиопротекторов |
1,08 |
6,1 |
0,1320 |
0,0691 |
|
Среда Файбича |
1,25 |
18,9 |
< 0,0001 |
< 0,0001 |
|
Среда Файбича с аскорбиновой кислотой |
6,16 |
37,2 |
< 0,0001 |
< 0,0001 |
|
Пептон-сахарозо-глицериновая среда |
1,14 |
11,0 |
0,0005 |
0,0003 |
Таким образом, A. tenuissima К22 и G. Pannorum ВКМ F-4777D при лиофилизации продемонстрировали хорошую выживаемость конидий, которая даже без использования защитных сред сохраняется на уровне, вполне достаточном для практического использования лиофилизированных культур при хранении этих штаммов.
Заключение
- Оба изученных штамма демонстрируют высокую (75,9 % у A. tenuissima К22 и 82,0 % у G. pannorum ВКМ F-4777D) жизнеспособность конидий после лиофилизации без использования защитных сред.
- Защитные среды не оказывают статистически значимого влияния на выживаемость конидий A. tenuissima К22 и статистически значимо повышают выживаемость конидий G. Pannorum ВКМ F-4777D (в 1,16 раза при использовании среды Файбича и в 1,07 раза при использовании пептон-сахарозо-глицериновой среды).
- Введение в среду Файбича аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта ведет к значительному снижению доли выживших при лиофилизации конидий (в 10,61 раза у A. tenuissima К22 и в 2,15 раза у G. pannorum ВКМ F-4777D).
- На основе полученных результатов можно рекомендовать проведение лиофилизации конидий A. tenuissima К22 без использования защитных сред, а лиофилизацию конидий G. Pannorum ВКМ F-4777D – с использованием защитной среды Файбича либо без использования защитных сред.
