Санкт-Петербург, г. Санкт-Петербург и Ленинградская область, Россия
УДК 61 Медицина. Охрана здоровья
ГРНТИ 76.29 Клиническая медицина
ОКСО 31.08.57 Онкология
ББК 54 Клиническая медицина
ТБК 5007 Прочие
ТБК 574 Внутренние болезни
BISAC MED062000 Oncology
На модели лучевого цистита у крыс обнаружено уменьшение числа форменных элементов крови через 6 ч после локального облучения и повышение уровня внеклеточной ДНК через 6-24 ч с нормализацией через 48 ч после воздействия. Относительное изменение содержания внеклеточной ДНК (0 ч против 6 ч) коррелировало с изменениями триглицеридов (0 ч против 24 ч).
локальное облучение, форменные элементы крови, внеклеточная ДНК, триглицериды
Распространенным осложнением радиационной терапии злокачественных новообразований малого таза (например, предстательной железы, мочевого пузыря, шейки матки, эндометрия и рака прямой кишки) является лучевой цистит, он регистрируется у 5–15% пациентов [1]. Патофизиологию лучевого цистита связывают с гибелью клеток из-за повреждения ДНК или увеличения проницаемости клеточных мембран [2]. В области таза размещено от 50 до 60 % всей костномозговой ткани, и в ряде случаев, например, при лечении рака шейки матки показана корреляция между дозой облучения и гематологической токсичностью [3].
Полагают, что основным источником внеклеточной ДНК (внДНК) являются гемопоэтические клетки, погибшие путем апоптоза, некроза, фагоцитоза или иным способом. Ранее на модели ионизирующего облучения всего тела крыс с мощностью дозы 1,6 Гр/мин в диапазоне от 2 до 100 Гр было показано зависимое от дозы увеличение концентрации внНК в плазме крови [4]. Была показана возможность использования количественного определения внДНК и ее фракций для оценки степени лучевого поражения организма и прогноза состояния облученных [5, 6].
Цель работы - исследовать на модели лучевого цистита изменение числа форменных элементов крови, внДНК и некоторых других биохимических показателей обмена веществ в ранние сроки после локального облучения области таза самок крыс в дозе 25 Гр.
Материалы и методы
Исследование проведено на 12-недельных крысах-самках Вистар (n=20), массой 210±35 г «Рапполово». Было сформировано 2 группы: интактные (n=10) и подопытные (n=10). Работа осуществлена в соответствии с требованиями действующих стандартов по содержанию и использованию лабораторных животных. Облучение области мочевого пузыря крыс осуществляли на линейном ускорителе электронов Axesse фирмы Elekta (Швеция) с энергией квантов 6 МэВ в дозе 25 Гр. Анестезированное животное помещали в специальное фиксирующее устройство на деке стола линейного ускорителя.
Кровь у крыс брали из периферической вены в интервалы через 0, 6 и 24 и 48 ч месяц после облучения в вакутейнеры с ЭДТА для получения цельной крови и в пластиковые пробирки без наполнителя для получения сыворотки, которую отделяли центрифугированием при 900 g в течение 30 мин при комнатной температуре. Подсчет клеток крови (лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов) проводили на анализаторе «BC-2800Vet» фирмы Mindray (Китай). Содержание внДНК в сыворотке крови определяли количественным сэндвич-иммуноферментным анализом с использованием набора Cell Death Detection ELISA kit фирмы Roche, Sigma-Aldrich-Rus (Россия). Метод был ранее апробирован [7, 8]. Определение показателей биохимического анализа крови (холестерин, гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ), мочевина, триглицериды (ТГ), щелочная фосфатаза) проводили на анализаторе «Konelab 20» (фирма «Thermo Scientific», США).
Данные представлены как среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего). Анализ проводился при помощи программного обеспечения GraphPad Prism 7, значимость различий оценивалась по t-критерию Стьюдента, для поиска зависимостей между количественными данными вычислялся коэффициент корреляции Спирмена.
Результаты и обсуждение
Через 6 ч после облучения наблюдалось уменьшение абсолютного (×109 мг/л) числа лейкоцитов с 16,06±1,83 до 10,57±1,06, лимфоцитов с 11,44±1,30 до 5,84±0,47, моноцитов с 0,51±0,08 до 0,32±0,03, через 24 ч – гранулоцитов с 4,11±0,57 до 2,14±0,15. Общее число лейкоцитов, число моноцитов также оставались значимо ниже через 24 ч после облучения.
Через 6 ч после облучения наблюдалось повышение внДНК сыворотки крови с 7,70±0,55 до 11,20±1,33 нг/мкл. Через 48 ч после облучения содержание внДНК снижалось до 8,55±0,73 нг/мкл и не отличалось значимо от интактных животных. Нами обнаружено раннее пострадиационное повышение уровня внДНК, наступившее, по-видимому, в результате снижения числа лейкоцитов, однако по данным корреляционного анализа, значимых соотношений повышения содержания внДНК и снижения числа форменных элементов крови выявлено не было.
Впервые обнаруженное нами дозозависимое увеличение содержания внДНК в крови в ранние сроки после однократного облучения всего тела крыс [4, 5, 6] применимо также и при изучении ранних эффектов действия локального облучения, приближенного к используемому в клинике. Исследование внДНК применяют для ранней оценки эффективности радиотерапии онкологических больных, так, отмечают увеличение концентрации внДНК в крови уже через 4 ч после первого сеанса радиотерапии для пациентов с первичным раком печени или с метастазами [9], сохраняющееся и при современных методах лечения рака.
Облучение приводило к значимому снижению содержания ТГ сыворотки крови через 24 ч после воздействия, с 2,21±0,10 до 1,44±0,13 ммоль/л. Содержание ТГ в сыворотке крыс оставалось пониженным и через 1 месяц после облучения и составляло 1,31±0,15 ммоль/л, значимо ниже, чем у интактных (p<0,05). Содержание холестерина через 24 ч после локального облучения проявляло тенденцию к повышению, с 1,15±0,09 ммоль/л у интактных до 1,36±0,12 ммоль/л через 24 ч после облучения, однако достоверное отличие наблюдались лишь через 1 месяц после воздействия, когда содержание холестерина значимо повышалось до 1,43±0,11 ммоль/л (p<0,05). Значения других исследованных биохимических показателей в ранние сроки после локального облучения таза в дозе 25 Гр не менялись и составляли 6,38±1,24 ед/л – активность ГГТ, 137,5±24,0 ед/л – активность щелочной фосфатазы и 10,96±1,78 ммоль/л – концентрация мочевины.
По данным корреляционного анализа, относительное изменение содержания внДНК (0 ч против 6 ч) коррелировало с изменениями ТГ (0 ч против 24 ч): ТГ = 0,32 ± 0,08 * внДНК (R = 0,78, р <0,05).
В связи с усилением гибели клеток после воздействия радиации повышается количество продуктов их распада, разносимое кровотоком по всем системам организма и, по-видимому, способным взаимодействовать с различными тканями и органами. Отмечают, что внДНК опосредует как индуцируемый радиацией эффект свидетеля, так и адаптивный эффект [9], поскольку содержит окисленные азотистые основания, прежде всего 8-оксо-2'-дезоксигуанозин. Так, окисленная in vitro геномная ДНК человека вызывает те же эффекты, что и внДНК [10]. Было показано, что свободный 8-оксо-2'-дезоксигуанозин вызывает снижение в плазме крови ТГ при длительном, на протяжении 2 месяцев, интрагастральном введении мышам линий ККФн и db/db, генетически предрасположенным к ожирению и сахарному диабету-2-го типа, с признаками морфологических нарушений печени [11]. Аналогичный эффект был вызван при длительном, в течение двух недель, пероральном введении 8-оксо-2'-дезоксигуанозина мышам, нокаутным по гену аролипопротеину Е с лигированной сонной артерией и содержавшихся на обогащенной липидами диете. Наряду со снижением уровня ТГ в плазме крови, наблюдали уменьшение площади склеротических бляшек [11]. Данные о ранних изменениях ТГ после локального облучения области малого таза получены нами впервые. В эпидемиологических исследованиях показано, что некоторые варианты печеночной липазы значимо взаимосвязаны с уровнем 8-оксо-2'-дезоксигуанозина, а другие – с содержанием ТГ [12]. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы ответить на вопрос, имеет ли обнаруженное действие защитный эффект или способствует развитию осложнений.
Заключение. Значимое снижение форменных элементов крови, повышение внДНК в ранние (6-24 ч) сроки после локального облучения можно считать маркерами развития лучевого цистита, влияющими на метаболизм, вызывая снижение содержания ТГ.
1. Hyperbaric oxygen therapy for radiation cystitis after pelvic radiotherapy: Systematic review of the recent literature / Villeirs L., Tailly T. Ost P. et al. // International Journal of Urology. 2020. V. 27, №2. P.98–107.
2. Zwaans B.M., Chancellor M.B., Lamb L.E. Modeling and Treatment of Radiation Cystitis // Urology. 2016. V. 88. P. 14–21.
3. Mohamed N.E., Ashour S.E. Role of ethanolic extract of Morus alba leaves on some biochemical and haematological alterations in irradiated male rats // International Journal of Radiation Biology. 2018. V. 94, №4. P.374–384.
4. Extracellular DNA level in the blood of irradiated rats / Vladimirov V.G., Belokhvostov A.S., Sherlina S.S. et al. // International Journal of Radiation Biology. 1992. V. 62, №6. P. 667–671.
5. Vasilyeva I.N. Low-molecular-weight DNA in blood plasma as an index of the influence of ionizing radiation // Annals NY Academy of Science. 2001. V.945. P.221–228.
6. Vasilyeva I., Bespalov V., Baranova A. Radioprotective combination of α-tocopherol and ascorbic acid promotes apoptosis that is evident by release of low-molecular weight DNA fragments into circulation // International Journal of Radiation Biology. 2015. V. 91, №11. P. 872–877.
7. Cell-free DNA plasma levels differ in age-specific pattern in healthy rats and castrated with testosterone-induced benign prostatic hyperplasia / Vasilyeva I.N., Bespalov V.G., Von J.D. et al. // International Journal of Genomics. 2019. 2019:8173630.
8. Внеклеточная ДНК у старых и молодых животных с индуцированной доброкачественной гиперплазией предстательной железы / Васильева И.Н., Беспалов В.Г., Точильников Г.В. и др. // Материалы XII междунар. науч. конф. «Системный анализ в медицине» (САМ 2018) / под ред. В.П. Колосова. Благовещенск, 2018. С. 106–110.
9. Васильева И.Н., Подгорная О.И., Беспалов В.Г. Нуклеосомная фракция внеклеточной ДНК как показатель апоптоза // Цитология.2015. Т. 57, №2. С. 87–94.
10. “ДНК-сигнальный” путь, обеспечивающий развитие радиационного эффекта свидетеля в клетках человека / Ермаков А.В., Конькова М.С., Костюк С.В., Вейко Н.Н. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2011. Т. 51, №6. С. 651–659.
11. Экзогенный 8-оксо-7,8-дигидро-2’-дезоксигуанозин: биомедицинские свойства, механизмы действия, терапевтический потенциал /Черников А.В., Гудков С.В., Усачева А.М., Брусков В.И. // Успехи биологической химии. 2017. Т. 57. С. 267–302.
12. Pleiotropic association of LIPS variants with lipid and urinary 8-hydroxy deoxyguanosine levels in a Taivanese populations / Teng M.-Sh., Wu S., Hsu L.A. et al. // Lipids in Health and Disease. 2019. V.18, №1. P.111.
