УДК 61 Медицина. Охрана здоровья
ГРНТИ 76.03 Медико-биологические дисциплины
ОКСО 31.08.29 Гематология
ББК 54 Клиническая медицина
ТБК 5703 Общие работы по здравоохранению и медицинской науке
BISAC MED014000 Clinical Medicine
Цель данного исследования - сравнительная оценка сдвигов кристаллогенных свойств плазмы крови при обработке гелиевой холодной плазмой и неионизированным потоком гелия. Установлено, что холодная гелиевая плазма и неионизированный поток гелия оказывают модифицирующее влияние на кристаллогенные свойства плазмы крови при обработке in vitro.
холодная плазма, биологические эффекты, плазма крови, кристаллогеные свойства
Исследования в области физики плазмы проводятся уже на протяжении длительного времени в России и за рубежом [3-9]. В то же время биомедицинские аспекты действия холодной плазмы различного происхождения и состава рассмотрены существенно менее подробно. В первую очередь эти данные относятся к оценке клинических перспектив применения генераторов холодной плазмы [3, 6-9], в том числе аппарата «Плазон» (МГТУ им. Н.Э. Баумана) [8], газовый поток от которых формируется в большинстве вариантов из атмосферного воздуха и дозируется по концентрации монооксида азота либо других соединений с известной биологической активностью.
С другой стороны, эффекты именно самой холодной плазмы изучены лишь в единичных публикациях [3, 4, 7], преимущественно посвященных дезинфицирующим свойствам данного воздействия [3-7], тогда как биологические эффекты холодной плазмы, составляющие базис ее клинического применения, исследованы относительно слабо. В немногочисленных работах, в которых рассматривается влияние этого фактора на биосистемы, использовали либо воздушную [3-5, 7-9], либо аргоновую плазму [6].
На основании этого целью данного исследования служила сравнительная оценка сдвигов окислительного метаболизма и кристаллогенных свойств плазмы крови при обработке гелиевой холодной плазмой и неионизированным потоком гелия.
Материал и методы
В эксперименте были использованы образцы цельной крови здоровых добровольцев (n=10). Для осуществления воздействия нами была собрана специальная установка, позволяющая проводить непосредственную обработку образцов крови холодной плазмой. В данной установке использовали холодную плазму, генерированную за счет воздействия СВЧ-излучения на поток гелия в аппарате собственной конструкции, разработанном в ИПФ РАН (г. Нижний Новгород). Продолжительность воздействия составляла 1 и 3 мин.
Для проведения эксперимента образцы крови делили на 5 равных порций по 1,5 мл, причем первая из них являлась контрольной (с ней не осуществляли никаких манипуляций), вторую и третью обрабатывали холодной плазмой с указанными выше экспозициями, а четвертую и пятую – потоком гелия без перевода его в плазменную форму. Экспозиция по завершении воздействия составляла 10 мин. Сразу после этого из образцов цельной биологической жидкости стандартным методом центрифугирования выделяли плазму крови.
Для изучения кристаллогенных свойств плазму крови в объеме 100 мкл. наносили на предметное стекло и приготавливали микропрепараты высушенной биологической жидкости в соответствии с методом кристаллоскопии, позволяющим оценивать собственную дегидратационную структуризацию биосреды [1, 2]. Высушенные микропрепараты оценивали морфологически (путем описания особенностей структуризации высушенного образца биологической жидкости) и визуаметрически (с применением собственной системы параметров) [1, 2]. Основными визуаметрическими показателями, оцениваемыми в балльной шкале, служили кристаллизуемость (отражает количественную сторону кристаллизации – плотность кристаллических элементов в фации), индекс структурности (характеризует сложность структуропостроения), степень деструкции фации (представляет собой индикатор качественной стороны процесса – правильности образования структур) и выраженность краевой зоны микропрепарата [1].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 6.1 for Windows. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Н-критерий Краскала-Уоллеса. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.
Результаты
Оценка влияния холодной гелиевой плазмы на кристаллогенные свойства плазмы крови также позволила продемонстрировать неодинаковость эффекта данного воздействия, причем лимитирующим фактором явилась продолжительность обработки. Так, при обработке крови неионизированным потоком гелия в кристаллоскопических фациях плазмы крови отмечали снижение кристаллогенной активности биосреды, что проявлялось в уменьшении плотности структурных элементов по сравнению с картинами кристаллизации интактной плазмы крови человека. Кроме того, при данном воздействии имело место преимущественное образование одиночных кристаллов и единичных аморфных тел с высокой степенью деструкции. Также в этих образцах наблюдали формирование хаотичных разломов, распространяющихся практически по всему микропрепарату без изменения диаметра краевой зоны фации.
Наиболее оптимальный характер дегидратационной структуризации плазмы крови зарегистрирован при обработке биосреды холодной плазмой в течение 1 минуты. Выявлено, что указанный режим воздействия способствовал образованию регулярной, симметричной картины, включающей совокупность центростремительных разломов, делящих образец на практически равные отдельности. Также фиксировали значительную активацию структуризации биологической жидкости относительно контрольного образца, преимущественно реализуемую за счет увеличения плотности кристаллических элементов, среди которых встречались и дендритные (в первую очередь – в центральной зоне микропрепарата). Следует подчеркнуть, что в этом случае конфигурация структур была близка к оптимальной, а процессы их разрушения – минимально выражены. Краевая зона фаций при обработке холодной плазмой в течение 1 минуты не претерпевала значительных качественных и количественных преобразований.
Увеличение продолжительности воздействия холодной гелиевой плазмой до 3 минут оказывало менее благоприятный эффект в отношении кристаллогенных свойств биологической среды. В частности, в этих фациях обнаруживали тенденцию к умеренной хаотизации разломов, неоднородность текстуры и небольшое усложнение формируемых элементов, среди которых появляются единичные неразветвленные дендритные кристаллы. Важно, что при данном режиме обработки регистрировали повышение степени разрушенности последних, достигающее средней степени, в то время как краевая зона микропрепаратов умеренно сужается.
Результаты морфологического описания собственной кристаллизации плазмы крови при воздействии холодной гелиевой плазмы и неионизированного гелия полностью подтверждаются данными их визуаметрической оценки. Так, показанная выше тенденция к стимуляции кристаллогенной активности биосреды под влиянием потока холодной плазмы реализовалась в повышении кристаллизуемости и/или индекса структурности этих образцов по отношению к контрольным, причем выраженность данного эффекта была обратно пропорциональна продолжительности обработки. В частности, при 1-минутной экспозиции отмечали существенное, статистически значимое увеличение как плотности структурных элементов фации, оцениваемой по уровню кристаллизуемости, так и сложности кристаллов, описываемой индексом структурности (p<0,05 по сравнению с фацией плазмы крови, на которую не оказывали никаких воздействий). При удлинении продолжительности обработки биосубстрата холодной плазмой до 3 минут отмечали более чем двухкратное повышение индекса структурности (в 2,41 раза; p<0,05 относительно контрольного образца).
Напротив, воздействие на плазму крови человека гелиевого потока, не подвергавшегося предварительной ионизации, демонстрирует обратную тенденцию. Кратковременная обработка биосреды гелием (1 минута) не оказывала значимого модифицирующего влияния на ее кристаллогенную активность, на что указывает сохранение уровня кристаллизуемости и индекса структурности. Увеличение длительности обработки биожидкости (3 минуты) усиливало ингибирующий эффект воздействия, причем в этом режиме по обоим указанным показателям наблюдали достоверное снижение значений (p<0,05 по сравнению с интактным образцом биологической жидкости).
По основному критерию правильности кристаллогенеза – степени деструкции фации – обнаружена монотонная тенденция нарастания уровня параметра при увеличении длительности воздействия. При этом эти сдвиги в большей степени выражены при обработке биосреды неионизированным потоком гелия. Следует отметить, что по этому показателю все образцы, подвергнутые воздействиям, демонстрируют статистически значимо повышенные значения относительно интактного (p<0,05). Это косвенно указывает на более оптимальную реакцию кристаллогенных свойств биожидкости на обработку холодной гелиевой плазмой по сравнению с гелиевым потоком, а также предпочтительность кратковременной обработки (1 мин).
Интегральную оценку состояния протеомного компонента плазмы крови при действии гелиевого потока, неионизированного и переведенного в плазменную форму, проводили на основании анализа выраженности краевой зоны микропрепаратов высушенной биологической жидкости. Установлено, что оба указанных воздействия при экспозиции 1 минута не оказывают значимого влияния на данный показатель, тогда как увеличение продолжительности обработки крови до 3 минут приводит к умеренному сужению краевого пояса дегидратированных образцов плазмы крови человека (p<0,05 по отношению к контрольным фациям). При этом наличие ионизации не влияет на выраженность указанной тенденции.
Заключение. Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что холодная гелиевая плазма и неионизированный поток гелия оказывают модифицирующее влияние на кристаллогенные свойства плазмы крови при обработке in vitro. Для холодной гелиевой плазмы оно проявилось в стимуляции кристаллогенной активности, тогда как у потока гелия обнаружена способность угнетать дегидратационную структуризацию биосреды. При этом наиболее оптимальной для действия рассматриваемого фактора является 1-минутная экспозиция.
1. Мартусевич А.К. Биокристалломика в молекулярной медицине. СПб.: Издательство СПбГМУ, 2011.
2. Мартусевич А.К., Перетягин С.П. Модификация дегидратационной структуризации сыворотки крови при ее обработке оксидом азота // Биофизика. 2013. Т. 58, №6. С. 1038-1042.
3. Alkawareek M.Y., Gorman S.P., Graham W.G., Gilmore B.F. Potential cellular targets and antibacterial efficacy of atmospheric pressure non-thermal plasma // Int J. Antimicrob. Agents. 2014. Vol. 43. P. 154–160.
4. Dobrynin D., Fridman D., Friedman G., Fridman A. Physical and biological mechanisms of direct plasma interaction with living tissue // New J. Phys. 2009. Vol. 11. P. 1–26.
5. Comparative in vitro study of different atmospheric pressure plasma jets concerning their antimicrobial potential and cellular reaction / K. Duske et al. // Plasma Process Polym. 2015. Vol. 12. P. 1050-1060.
6. Bactericidal effects of non-thermal argon plasma in vitro, in biofilms and in the animal model of infected wounds / Ermolaeva S.A., Varfolomeev A.F., Chernukha M.Yu. et al. // J. Med. Microbiol. 2011. Vol. 60. P. 75–83.
7. Potential cellular targets and antibacterial efficacy of atmospheric pressure non-thermal plasma / Flynn P.B., Busetti A., Wielogorska E. et al. // Sci. Rep. 2016. Vol. 6. P. 26320.
8. Beneficial effect of gaseous nitric oxide on the healing of skin wounds / Shekhter A.B., Serezhenkov V.A., Rudenko T.G. et al. // Nitric oxide. 2005. Vol. 12. P. 210-219.
9. Dose- and Time-Dependent Cellular Effects of Cold Atmospheric Pressure Plasma Evaluated in 3D Skin Models / Wiegand C., Fink S., Beier O. et al. // Skin Pharmacol. Physiol. 2016. Vol. 29. P. 257-265.
