Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
UDK 61 Медицина. Охрана здоровья
GRNTI 76.03 Медико-биологические дисциплины
OKSO 31.08.45 Пульмонология
BBK 541 Внутренние болезни
TBK 57 Медицина. Фармакология
BISAC MED079000 Pulmonary & Thoracic Medicine
An approach to the study of cellular inflammation using methods of cytochemical analysis of sputum in patients with bronchial asthma with different types of airway reactions to bronchoprovocation with cold air is presented. Endotyping of patients contributes to a better understanding of the pathophysiological mechanisms and the choice of treatment tactics for the disease.
bronchial asthma, cold, sputum, inflammation, airway enzyme activity, statistical research methods
С проблемой окислительного повреждения клеток связан вопрос лабилизации мембран лизосом и высвобождения во внешнюю среду лизосомных ферментов фагоцитов [1]. Поскольку типовым патологическим процессом для заболеваний респираторного тракта является оксидативный стресс [2], актуален вопрос влияния оксидантов, продуцируемых при холод-индуцированном стрессе, на секрецию лизосомных ферментов фагоцитами дыхательных путей. Ферментативная и секреторная активность лизосом фагоцитов бронхов больных бронхиальной астмой (БА) под влиянием холодового стимула не изучена.
Цель работы. Оценить активность ферментов лизосом и возможности лизосомной секреции фагоцитов дыхательных путей больных БА при воздействии холодового стимула на примере фосфатаз бронхиальных нейтрофилов.
Материал и методы. У 13 больных персистирующей БА лёгкого течения [3], (средний возраст 47,4±4,3 лет) проводили базовое исследование вентиляционной функции лёгких с анализом кривой поток-объем форсированного выдоха при рутинной спирометрии (Easy on PC, ndd Medizintechnik AG, Швейцария) с последующей оценкой реакции дыхательных путей на холодовой стимул при проведении стандартной 3-минутной изокапнической гипервентиляции холодным (-20ºС) воздухом (ИГХВ) [4]; осуществляли сбор образцов индуцированной мокроты в день, предшествующий дню проведения бронхопровокационной пробы ИГХВ, и спонтанно продуцируемой мокроты непосредственно после окончания пробы.
По стандартным методикам осуществляли цитологическое и цитохимическое исследование мокроты. Подсчитанное в цитологических мазках число клеток выражали в процентах; показатель цитоза определяли по количеству клеток в 1 мкл мокроты. Оценку реакции на активность кислой фосфатазы (КФ), щелочной фосфатазы (ЩФ), аденозинтрифосфатазы (АТФазы) в нейтрофилах мокроты проводили полуколичественным методом Kaplow (1955) с распределением клеток по группам в зависимости от интенсивности маркирующей активность фермента окраски продукта, образующегося в цитоплазме при взаимодействии фермента с субстратом. В 0 группу включали клетки без гранул, в I группу – клетки низкой степени активности фермента, содержащие единичные гранулы (площадь специфической окраски и заполнение цитоплазмы гранулами до 25 % цитоплазмы), во II группу – клетки средней степени активности фермента (площадь окраски и заполнение цитоплазмы гранулами до 30-70 %), в III группу – клетки высокой степени активности фермента (площадь окраски и заполнение цитоплазмы гранулами до 70-100 %) с экзоцитозом гранул и гранулярного содержимого. Путём световой микроскопии в мазке подсчитывали 100 нейтрофилов, дифференцируя клетки по уровню окраски. Средний цитохимический индекс (СЦИ, в условных единицах) рассчитывали по формуле: СЦИ = (0×Н0 + 1×НI + 2×НII + 3×НIII)/100, где Н0, НI, НII, НIII – число нейтрофилов соответствующей группы.
Статистический анализ полученного материала проводили на основе стандартных методов вариационной статистики с использованием программы «Автоматизированная система диспансеризации» [5]. Оценку соответствия признака закону нормального распределения проводили при помощи критериев Колмогорова-Смирнова, Пирсона-Мизеса. При нормальном типе распределения использовали парный критерий t (Стьюдента), при распределении данных, отличном от нормального, применяли парный критерий Уилкоксона. Описательная статистика количественных признаков представлена с помощью средней арифметической, стандартной ошибки средней арифметической (M±m), а также медианы и квартилей (Me (Q1; Q3)). Для всех величин принимались во внимание уровень статистической достоверности различий (р) менее 0,05.
Результаты. Исходное значение ОФВ1 в среднем по группе составило 97,9±5,3%, ОФВ1/ЖЕЛ 73,3±2,6%, постбронходилатационный прирост ОФВ1 (%) в ответ на введение короткодействующего β2-агониста 6,5(3,09; 16,0), изменение ОФВ1 (%) после пробы ИГХВ -2,0 (-8,0; 2,0). В мокроте больных после воздействия холодового стимула наблюдали увеличение цитоза с 1,48±0,17 до 2,2±0,22 (р˂0,05), а также изменение в клеточном составе и уровне активности лизосомных ферментов нейтрофилов. При наличии тенденции к снижению количества нейтрофилов (47,6±2,92 vs. 42,3±3,83%) отмечен достоверный прирост числа эозинофилов с 1,88±0,33 до 7,8±2,70% (р˂0,05), макрофагов с 36,8±2,78 до 43,8±2,71%, при уменьшении процентного содержания лимфоцитов с 2,8±0,24 до 1,2±0,21% (р˂0,001) и клеток бронхиального эпителия с 11,64±1,67 до 4,6±2,1% (р˂0,05).
В ответ на пробу ИГХВ в мокроте пациентов повышалось содержание нейтрофилов со средней и высокой степенью активности КФ, высокой степенью активности ЩФ и АТФазы (рис. 1). Процентное содержание нейтрофилов II группы для КФ после пробы ИГХВ увеличивалось с 23,4±1,94 до 40,1±4,30 % (р˂0,01) и III группы для КФ с 4,1±1,38 до 9,0±2,95 %. Для ЩФ количество нейтрофилов III группы до и после пробы составляло 13,7±4,22 и 15,7±3,46 %, для АТФазы – 3,50±2,70 и 7,22±2,64 %, соответственно. Количество нейтрофилов, не содержавших гранул КФ (0 группа), после пробы уменьшалось с 15,1±3,58 до 5,2±2,78 % (р˂0,05), с чем могло быть связано снижение содержания нейтрофилов и сопутствующее повышение содержания эозинофилов и макрофагов в клеточном составе мокроты в ответ на пробу. Уменьшение содержания нейтрофилов с наибольшей вероятностью было обусловлено клеточной деструкцией, следующей за функциональным напряжением и разрушением мембран клеток при экзоцитозе КФ. Напротив, число нейтрофилов 0 группы, лишённых активности ЩФ и АТФазы, под воздействием холодового стимула увеличивалось, составляя для ЩФ 46,3±3,85 % при исходном значении 39,4±4,8 %; для АТФазы - 19,0±5,11 % при исходном значении 15,0±3,57 %.
Рис. 1 Распределение клеток нейтрофилов мокроты по группам (0-3) в зависимости от интенсивности маркирующей активность фермента окраски продукта, образующегося в цитоплазме при взаимодействии фермента с субстратом исходно и после пробы ИГХВ (а - активность кислой фосфатазы; б - активность щелочной фосфотазы; в - активность аденозинтрифосфатазы). Значимость различий: * - р˂0,05; ** - р˂0,01
Предположительно, отрицательная активность в нейтрофилах ЩФ и АТФазы могла быть вызвана временным опустошением запаса гидролаз в клетках на фоне усиленной дегрануляции, приводящей к эпителиальной дисфункции, о чем свидетельствовало снижение количества бронхиального эпителия после пробы, и сопровождающейся просветлением цитоплазмы нейтрофилов, освобождённой от гранул. На то, что в условиях холод-индуцированного стресса в дыхательных путях пациентов наряду с секрецией нейтрофилами лизосомных ферментов активировался и синтез нейтрофильных фосфатаз, указывали установленные показатели СЦИ, составившие исходно и после пробы ИГХВ для КФ – 1,11±0,06 и 1,42±0,06 (р˂0,01), для ЩФ – 1,68±0,09 и 1,69±0,06, для АТФазы – 1,22±0,06 и 1,28±0,09, соответственно.
Заключение. Отсутствие очевидной реакции бронхов больных БА на холодовой стимул не исключает стимулированного холод-индуцированным оксидативным стрессом повышения активности синтезируемых и секретируемых бронхиальными нейтрофилами фосфатаз, потенцирующих процессы трансфосфорилирования и деэнергизации клеток-мишеней бронхов при персистирующем воспалении в дыхательных путях.
1. Pupyshev A.B. Lizosomy cheloveka: bibliometricheskaya ocenka aktual'nyh napravleniy issledovaniy // Byulleten' SO RAMN. 2006. T. 119, №1. S. 106–116.
2. Fedoseeva N.M., Perel'man Yu.M. Rol' svobodnoradikal'nogo okisleniya v patogeneze bronhial'noy astmy i giperreaktivnosti dyhatel'nyh putey // Byulleten' fiziologii i patologii dyhaniya. 2008. Vyp. 29. S.38-44.
3. Global Initiative for Asthma (GINA). Global strategy for asthma management and prevention (2018 update). URL: http://www.ginasthma.com.
4. Perel'man Yu.M., Prihod'ko A.G. Metodika kombinirovannoy diagnostiki narusheniy kondicioniruyuschey funkcii i holodovoy giperreaktivnosti dyhatel'nyh putey // Byulleten' fiziologii i patologii dyhaniya. 2002. Vyp. 12. S.22-28.
5. Ul'yanychev N.V. Sistemnost' nauchnyh issledovaniy v medicine. Saarbrücken: LAP LAMBERT, 2014. 140 s.
