Благовещенск, Амурская область, Россия
Благовещенск, Амурская область, Россия
Благовещенск, Амурская область, Россия
Благовещенск, Амурская область, Россия
Благовещенск, Амурская область, Россия
УДК 61 Медицина. Охрана здоровья
ГРНТИ 76.03 Медико-биологические дисциплины
ОКСО 31.08.45 Пульмонология
ББК 541 Внутренние болезни
ТБК 57 Медицина. Фармакология
BISAC MED079000 Pulmonary & Thoracic Medicine
Представлен подход к изучению клеточного воспаления с привлечением методов цитохимического анализа мокроты у больных бронхиальной астмой с разными типами реакции дыхательных путей на бронхопровокацию холодным воздухом. Эндотипирование больных способствует лучшему пониманию патофизиологических механизмов и выбору тактики лечения болезни.
бронхиальная астма, холод, мокрота, воспаление, активность ферментов дыхательных путей, статистические методы исследования
С проблемой окислительного повреждения клеток связан вопрос лабилизации мембран лизосом и высвобождения во внешнюю среду лизосомных ферментов фагоцитов [1]. Поскольку типовым патологическим процессом для заболеваний респираторного тракта является оксидативный стресс [2], актуален вопрос влияния оксидантов, продуцируемых при холод-индуцированном стрессе, на секрецию лизосомных ферментов фагоцитами дыхательных путей. Ферментативная и секреторная активность лизосом фагоцитов бронхов больных бронхиальной астмой (БА) под влиянием холодового стимула не изучена.
Цель работы. Оценить активность ферментов лизосом и возможности лизосомной секреции фагоцитов дыхательных путей больных БА при воздействии холодового стимула на примере фосфатаз бронхиальных нейтрофилов.
Материал и методы. У 13 больных персистирующей БА лёгкого течения [3], (средний возраст 47,4±4,3 лет) проводили базовое исследование вентиляционной функции лёгких с анализом кривой поток-объем форсированного выдоха при рутинной спирометрии (Easy on PC, ndd Medizintechnik AG, Швейцария) с последующей оценкой реакции дыхательных путей на холодовой стимул при проведении стандартной 3-минутной изокапнической гипервентиляции холодным (-20ºС) воздухом (ИГХВ) [4]; осуществляли сбор образцов индуцированной мокроты в день, предшествующий дню проведения бронхопровокационной пробы ИГХВ, и спонтанно продуцируемой мокроты непосредственно после окончания пробы.
По стандартным методикам осуществляли цитологическое и цитохимическое исследование мокроты. Подсчитанное в цитологических мазках число клеток выражали в процентах; показатель цитоза определяли по количеству клеток в 1 мкл мокроты. Оценку реакции на активность кислой фосфатазы (КФ), щелочной фосфатазы (ЩФ), аденозинтрифосфатазы (АТФазы) в нейтрофилах мокроты проводили полуколичественным методом Kaplow (1955) с распределением клеток по группам в зависимости от интенсивности маркирующей активность фермента окраски продукта, образующегося в цитоплазме при взаимодействии фермента с субстратом. В 0 группу включали клетки без гранул, в I группу – клетки низкой степени активности фермента, содержащие единичные гранулы (площадь специфической окраски и заполнение цитоплазмы гранулами до 25 % цитоплазмы), во II группу – клетки средней степени активности фермента (площадь окраски и заполнение цитоплазмы гранулами до 30-70 %), в III группу – клетки высокой степени активности фермента (площадь окраски и заполнение цитоплазмы гранулами до 70-100 %) с экзоцитозом гранул и гранулярного содержимого. Путём световой микроскопии в мазке подсчитывали 100 нейтрофилов, дифференцируя клетки по уровню окраски. Средний цитохимический индекс (СЦИ, в условных единицах) рассчитывали по формуле: СЦИ = (0×Н0 + 1×НI + 2×НII + 3×НIII)/100, где Н0, НI, НII, НIII – число нейтрофилов соответствующей группы.
Статистический анализ полученного материала проводили на основе стандартных методов вариационной статистики с использованием программы «Автоматизированная система диспансеризации» [5]. Оценку соответствия признака закону нормального распределения проводили при помощи критериев Колмогорова-Смирнова, Пирсона-Мизеса. При нормальном типе распределения использовали парный критерий t (Стьюдента), при распределении данных, отличном от нормального, применяли парный критерий Уилкоксона. Описательная статистика количественных признаков представлена с помощью средней арифметической, стандартной ошибки средней арифметической (M±m), а также медианы и квартилей (Me (Q1; Q3)). Для всех величин принимались во внимание уровень статистической достоверности различий (р) менее 0,05.
Результаты. Исходное значение ОФВ1 в среднем по группе составило 97,9±5,3%, ОФВ1/ЖЕЛ 73,3±2,6%, постбронходилатационный прирост ОФВ1 (%) в ответ на введение короткодействующего β2-агониста 6,5(3,09; 16,0), изменение ОФВ1 (%) после пробы ИГХВ -2,0 (-8,0; 2,0). В мокроте больных после воздействия холодового стимула наблюдали увеличение цитоза с 1,48±0,17 до 2,2±0,22 (р˂0,05), а также изменение в клеточном составе и уровне активности лизосомных ферментов нейтрофилов. При наличии тенденции к снижению количества нейтрофилов (47,6±2,92 vs. 42,3±3,83%) отмечен достоверный прирост числа эозинофилов с 1,88±0,33 до 7,8±2,70% (р˂0,05), макрофагов с 36,8±2,78 до 43,8±2,71%, при уменьшении процентного содержания лимфоцитов с 2,8±0,24 до 1,2±0,21% (р˂0,001) и клеток бронхиального эпителия с 11,64±1,67 до 4,6±2,1% (р˂0,05).
В ответ на пробу ИГХВ в мокроте пациентов повышалось содержание нейтрофилов со средней и высокой степенью активности КФ, высокой степенью активности ЩФ и АТФазы (рис. 1). Процентное содержание нейтрофилов II группы для КФ после пробы ИГХВ увеличивалось с 23,4±1,94 до 40,1±4,30 % (р˂0,01) и III группы для КФ с 4,1±1,38 до 9,0±2,95 %. Для ЩФ количество нейтрофилов III группы до и после пробы составляло 13,7±4,22 и 15,7±3,46 %, для АТФазы – 3,50±2,70 и 7,22±2,64 %, соответственно. Количество нейтрофилов, не содержавших гранул КФ (0 группа), после пробы уменьшалось с 15,1±3,58 до 5,2±2,78 % (р˂0,05), с чем могло быть связано снижение содержания нейтрофилов и сопутствующее повышение содержания эозинофилов и макрофагов в клеточном составе мокроты в ответ на пробу. Уменьшение содержания нейтрофилов с наибольшей вероятностью было обусловлено клеточной деструкцией, следующей за функциональным напряжением и разрушением мембран клеток при экзоцитозе КФ. Напротив, число нейтрофилов 0 группы, лишённых активности ЩФ и АТФазы, под воздействием холодового стимула увеличивалось, составляя для ЩФ 46,3±3,85 % при исходном значении 39,4±4,8 %; для АТФазы - 19,0±5,11 % при исходном значении 15,0±3,57 %.
Рис. 1 Распределение клеток нейтрофилов мокроты по группам (0-3) в зависимости от интенсивности маркирующей активность фермента окраски продукта, образующегося в цитоплазме при взаимодействии фермента с субстратом исходно и после пробы ИГХВ (а - активность кислой фосфатазы; б - активность щелочной фосфотазы; в - активность аденозинтрифосфатазы). Значимость различий: * - р˂0,05; ** - р˂0,01
Предположительно, отрицательная активность в нейтрофилах ЩФ и АТФазы могла быть вызвана временным опустошением запаса гидролаз в клетках на фоне усиленной дегрануляции, приводящей к эпителиальной дисфункции, о чем свидетельствовало снижение количества бронхиального эпителия после пробы, и сопровождающейся просветлением цитоплазмы нейтрофилов, освобождённой от гранул. На то, что в условиях холод-индуцированного стресса в дыхательных путях пациентов наряду с секрецией нейтрофилами лизосомных ферментов активировался и синтез нейтрофильных фосфатаз, указывали установленные показатели СЦИ, составившие исходно и после пробы ИГХВ для КФ – 1,11±0,06 и 1,42±0,06 (р˂0,01), для ЩФ – 1,68±0,09 и 1,69±0,06, для АТФазы – 1,22±0,06 и 1,28±0,09, соответственно.
Заключение. Отсутствие очевидной реакции бронхов больных БА на холодовой стимул не исключает стимулированного холод-индуцированным оксидативным стрессом повышения активности синтезируемых и секретируемых бронхиальными нейтрофилами фосфатаз, потенцирующих процессы трансфосфорилирования и деэнергизации клеток-мишеней бронхов при персистирующем воспалении в дыхательных путях.
1. Пупышев А.Б. Лизосомы человека: библиометрическая оценка актуальных направлений исследований // Бюллетень СО РАМН. 2006. Т. 119, №1. С. 106–116.
2. Федосеева Н.М., Перельман Ю.М. Роль свободнорадикального окисления в патогенезе бронхиальной астмы и гиперреактивности дыхательных путей // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2008. Вып. 29. С.38-44.
3. Global Initiative for Asthma (GINA). Global strategy for asthma management and prevention (2018 update). URL: http://www.ginasthma.com.
4. Перельман Ю.М., Приходько А.Г. Методика комбинированной диагностики нарушений кондиционирующей функции и холодовой гиперреактивности дыхательных путей // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2002. Вып. 12. С.22-28.
5. Ульянычев Н.В. Системность научных исследований в медицине. Saarbrücken: LAP LAMBERT, 2014. 140 с.
