Гиперреактивность дыхательных путей к холодовому триггеру у больных бронхиальной астмой (БА) сопровождается усугублением клинических проявлений болезни, проблемой купирования преходящего холодового бронхоспазма и высоким риском утраты контролируемого течения астмы на фоне применения базисной комбинированной противовоспалительной терапии [6, 7, 18].
Согласно концепции о существенной роли оксидативного стресса в патогенезе заболеваний органов дыхания, молекулярно-клеточный механизм холодиндуцированного бронхоспазма инициируется свободно-радикальным повреждением бронхов в результате гиперпродукции активных форм кислорода и еще более сильных окислителей – пероксинитрита, гипохлорита [10, 11]. Гипохлорит, наряду с гипобромитом и гипоиодитом, принадлежит к группе высоко реакционноспособных гипогалогенитов, или активных форм галогенов, образование которых при окислении галогенидов (Cl-, Вr-, I-) в присутствии Н2О2 катализируется лизосомальной нейтрофильной (эозинофильной) миелопероксидазой (МПО) [7]. Гипогалогениты модифицируют функциональные группы липидов, белков и углеводов [12, 19, 21], галогенируют и бромируют нуклеотиды ДНК, вызывая провоцируемые окислением мутации в клетках-мишенях [17].
Повреждающее действие реактивных и токсических молекул ограничивается системным влиянием плазменных регуляторных белков – реактантов острой фазы воспаления [4]. К негативным реактантам острофазового ответа на повреждение относится представитель семейства макроглобулинов, универсальный модулятор цитокинов альфа-2-макроглобулин (АМГ) [1, 2, 4], который является транспортером провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов, полиспецифичным ингибитором всех известных протеиназ и наиболее мощным ингибитором апоптоза, существенно превосходящим по суммарной ингибирующей способности серпины и антиоксиданты [1, 2]. Вследствие высокого сродства к рецептору эндоцитоза, позволяющего активировать механизм фагоцитоза, данный белок активно участвует в нейтрализации патогенов фагоцитами и презентации антигенов иммунокомпетентным клеткам. Фагоцитоз патогенов приводит как к их нейтрализации, так и антигенному распознаванию, в результате чего активируется специфический антителогенез. Падение плазменной концентрации АМГ как основного цинк-транспортирующего белка создает резерв свободного цинка в циркуляции, что способствует запуску цинкзависимого гормона тимулина, активизирующего систему цитотоксических лимфоцитов и лимфоцитов-киллеров [2].
Регуляторная функция АМГ, потенцирующая устойчивость к повреждению, сбалансированность морфофизиологических взаимодействий между повреждающими и защитно-восстановительными звеньями острофазового ответа и превалированию пролиферативно-репаративных процессов на поздних стадиях воспаления [1, 2, 4], не исследована у больных БА с гиперрреактивностью дыхательных путей к холодовому триггеру.
Целью настоящей работы явилось изучение активности АМГ во взаимосвязи с окислительной пероксидазной активностью и клинико-функциональными проявлениями болезни у больных БА с холодовой гиперреактивностью дыхательных путей (ХГДП).
Материалы и методы исследования
Было спланировано и проведено по единому протоколу обследование 28 больных легкой персистирующей БА неконтролируемого течения согласно критериям GINA [14]. Критерием включения в исследование служили: отсутствие острой респираторной инфекции в течение последних 4 недель; значимой патологии других органов и систем, способной повлиять на результаты исследования; объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) 80% и более от должного значения. Испытуемые были хорошо информированы о вынужденном дискомфорте, сопровождающем ингаляционные провокационные тесты. Во избежание влияний циркадных ритмов на результаты исследования все пациенты обследовались в первую половину дня Клиническое исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием человека в качестве субъекта» с поправками 2013 г. и нормативными документами «Правила надлежащей клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом №200н от 01.04.2016 МЗ РФ. Планируемая работа прошла этическую экспертизу локального комитета по биомедицинской этике ДНЦ ФПД, все пациенты были ознакомлены предстоящим исследованием и подписывали информационное соглашение об участии.
Дизайн работы предполагал первичный клинический осмотр больного, оценку симптомов астмы и уровня контроля над заболеванием по вопроснику Аsthma Control Test (АСТ, баллы), исследование вентиляционной функции легких, выявление ХГДП, сбор и анализ индуцированной мокроты (ИМ).
Для оценки функции внешнего дыхания проводилось спирометрическое исследование на аппарате Easy on-PC (nddMedizintechnik AG, Швейцария) с последующей проверкой параметров кривой «поток-объем» форсированного выдоха на обратимый компонент обструкции путём ингаляции 200 мкг сальбутамола.
Для верификации ХГДП выполнялась проба изокапнической гипервентиляции холодным воздухом (ИГХВ) в течение 3 минут охлаждённой до -20ºС воздушной смесью, содержащей 5% СО2. Уровень вентиляции соответствовал 60% должной максимальной вентиляции лёгких. Контрольные исследования вентиляционной функции лёгких выполнялись перед началом холодовой провокации и после неё на 1 и 5 минутах восстановительного периода. Основным критерием оценки служило падение ОФВ1 более чем на 10% от исходной величины сразу после провокации и более чем на 15% − через 5 минут после неё [9].
Сбор ИМ осуществлялся по стандартной методике, перед процедурой оценивали вентиляционную функцию легких путем спирометрии, затем больному через дозированный аэрозольный ингалятор вводился сальбутамол в дозе 200 мкг. Индукция мокроты осуществлялась ингаляцией 3-, 4- и 5%-го раствора NaCl с применением ультразвукового небулайзера (OMRON NE-U-17, Япония) сеансами по 7 мин, по завершении каждого сеанса определяли ОФВ1. При снижении показателя более 10% от исходного значения и/или получения удовлетворительного образца мокроты ингаляцию прекращали. Концентрацию АМГ (нг/мл) в ИМ определяли при помощи метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческого набора α2-Macroglobulin ELISA Kit (Immundiagnostik AG, Германия). Концентрацию МПО (нг/мл) в ИМ определяли методом ИФА на полуавтоматическом иммуноферментном анализаторе Multiskan Fc (Termo Fisher Scientific, Финляндия) с использованием коммерческого набора Bender Мed Systems для определения МПО (кат. №BMS2038).
Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов вариационной статистики. Для определения уровня статистической значимости различий использовали непарный критерий t (Стьюдента), в случаях негауссовых распределений − непараметрический критерий Колмогорова-Смирнова. С целью определения степени связи между двумя случайными величинами проводили корреляционный анализ, рассчитывали коэффициент корреляции (r). С целью установления формы зависимости и построения математической модели между случайной величиной и значениями нескольких переменных независимых величин проводилась пошаговая линейная регрессия. Для всех величин принимался во внимание минимальный уровень значимости (р) 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
По результатам реакции дыхательных путей на пробу ИГХВ больные БА были объединены в следующие группы: в 1 группу (18 человек) вошли пациенты с гиперреактивностью дыхательных путей на холодовой стимул, во 2 группу (10 человек) – с отсутствием реакции на пробу ИГХВ (табл. 1). Пациенты обеих групп были сопоставимы по антропометрическим данным. По данным АСТ больные, реагировавшие на холодный воздух, менее эффективно контролировали своё заболевание. У пациентов 1 группы регистрировались более низкие значения параметров бронхиальной проходимости, с достоверным снижением скоростных показателей форсированного выдоха (МОС50, СОС25-75) и, как следствие, их высокий прирост в реакции на β2-агонист.
Таблица 1
Клинико-функциональная характеристика больных БА (М±m)
|
Показатели |
1 группа |
2 группа |
р |
|
Возраст, лет |
34,8±2,4 |
39,7±2,6 |
0,21 |
|
Рост, см |
166,9±2,8 |
166,3±2,5 |
0,88 |
|
Вес, кг |
88,3±3,4 |
71,7±5,2 |
0,022 |
|
АСТ, баллы |
15,3±1,2 |
19,3±1,4 |
0,044 |
|
Спирометрия |
|||
|
ЖЕЛ, % долж. |
97,6±3,3 |
101,3±4,5 |
0,51 |
|
ОФВ1, % долж. |
84,1±4,0 |
93,5±6,1 |
0,19 |
|
МОС50, % долж |
54,1±5,0 |
83,2±15,0 |
0,032 |
|
СОС25-75, % долж. |
50,7±4,6 |
75,6±11,4 |
0,026 |
|
ОФВ1/ЖЕЛ |
0,68±0,02 |
0,75±0,02 |
0,026 |
|
Реакция дыхательных путей на β2-агонист |
|||
|
DОФВ1, % |
18,1±4,1 |
6,5±3,5 |
0,079 |
|
DМОС50, % |
43,5±10,1 |
11,9±7,1 |
0,05 |
|
DОФВ1/ЖЕЛ |
10,1±2,6 |
-1,6±2,5 |
0,011 |
|
Реакция дыхательных путей на пробу ИГХВ |
|||
|
DОФВ1, % |
-15,1±2,6 |
-3,4±1,4 |
0,005 |
|
DСОС25-75, % |
-23,0±3,8 |
-4,9±3,3 |
0,005 |
Примечание: здесь и далее р – достоверность различий показателей между группами; МОС50 – мгновенная объёмная скорость выдоха на уровне 50% ФЖЕЛ; СОС25-75 − средняя объемная скорость выдоха на уровне 25-75% ФЖЕЛ.
При исследовании ИМ у пациентов 1 группы, по сравнению с больными 2 группы, регистрировался достоверно более низкий уровень АМГ (табл. 2). Достоверных межгрупповых различий концентрации МПО в ИМ у обследованных больных обнаружено не было, однако в 1 группе прослеживалась тенденция к более высокому содержанию пероксидазы. Данное обстоятельство соответствовало полученным нами ранее сведениям о повышении количества МПО и пероксидазной активности гранулоцитов в бронхах больных БА с ХГДП [6–8].
Таблица 2
Содержание альфа-2-макроглобулина и миелопероксидазы в индуцированной мокроте больных БА (М±m)
|
Показатель |
1 группа |
2 группа |
р |
|
АМГ, нг/мл |
2,9±0,47 |
4,8±0,79 |
0,048 |
|
МПО, нг/мл |
130,4±37,7 |
96,8±41,4 |
0,58 |
Центральными параметрами воспаления бронхов у больных БА с ХГДП выступают активированный нейтрофильный пул и праймированная провоспалительными цитокинами активность гранулоцитов в отношении синтеза, внутригранулярного депонирования и экзоцитоза в экстрацеллюлярное пространство МПО [6–8, 20]. Активация окислительно-ферментативной функции нейтрофилов, стимулирующая респираторный взрыв, приводит к эскалации оксидативного стресса, персистенции воспаления, усилению гиперреактивности дыхательных путей, а также усугубляет клинические проявления астмы и снижает возможность достижения клинических критериев контроля над болезнью [6–8]. Установлено, что применение режима длительной терапии больных БА с ХГДП комбинированным противовоспалительным препаратом не позволяет в реальной клинической практике достигнуть контроля нейтрофильного сегмента воспаления [6]. Инерция изменений количества нейтрофилов в воспалительном инфильтрате в ответ на предложенное лечение связана с тем, что у астматиков нейтрофильный тип воспаления бронхов коррелирует с системным воспалением, отсюда клинические результаты лечения у таких больных хуже, чем у пациентов с ненейтрофильным (менее 64% нейтрофилов) фенотипом астмы [23].
При оценке активности исследуемого белка во внимание принималась ключевая функция АМГ и всех макроглобулинов – образование белково-лигандных комплексов, лигандами которых являются биологически активные вещества и медиаторы воспаления, а также учитывалась ведущая роль АМГ в ограничении ферментативных процессов [1, 2, 4]. Активация респираторного взрыва и свободно-радикального повреждения бронхов у лиц с ХГДП (1 группа) сопровождалась более низким, чем у больных 2 группы, уровнем АМГ, что могло быть связано с усилением расходования макроглобулина при холодовом бронхоспазме. Высокий показатель активности МПО свидетельствовал о поддержании в бронхах пациентов 1 группы большего, чем у представителей группы сравнения, уровня оксидативного и галогенирующего стресса. Системный контроль АМГ над локальным воспалением в дыхательных путях больных БА с ХГДП обеспечивается, вероятно, за счёт образования комплексов макроглобулина с регуляторными лигандами, инактивация которых приводит к снижению уровня повреждения в бронхах. В продукции лигандов и стимуляции воспаления задействованы оксиданты, активные формы кислорода и галогенов, генерируемые при участии МПО.
Известно, что в результате модификации оксидантами активности ядерного транскрипционного фактора kappa B (NF-kВ), отвечающего за адаптивные реакции клеток и ассоциированного с активностью воспаления при БА, индуцируется экспрессия генов иммунного, острофазового и воспалительного ответа, апоптоза и клеточного цикла [3, 12, 16]. Под влиянием NF-kВ стимулируется синтез цитокинов и хемокинов (IL 1−6, 8, 11, 13, 16−18, TNFα), белка RANTES, индуцибельных ферментов (NO-синтазы, циклооксигеназы-2, фосфолипазы-А2), NO, бронхоконстриктора эндотелина-1, белков комплемента (В, С3, С4), молекул адгезивных контактов (ICAM-1, VCAM-1, Е-cелектина), молекул межклеточной и сосудистой адгезии лейкоцитов, факторов, контролирующих клеточный цикл (р53, циклин D1), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), главного комплекса гистосовместимости (MHC-I, MHC-II), ингибиторов и активаторов апоптоза (с-IAP1, c-IAP2, FasL, Bcl-2, TRAF-1, TRAF-2), рецепторов субстанции Р (NK1-рецепторов), металлопротеиназ, активатора плазминогена [3]. По данным литературы, зарегистрированное в бронхиальном эпителии больных БА повышение активности NF-kВ способствует персистенции воспаления и поддержанию гиперреактивности дыхательных путей у пациентов с тяжёлой неконтролируемой БА [3, 13]. Так как экспрессия NF-kВ подавляет антивирусную и иммуномодуляторную активность интерферонов, активация NF-kВ при астме рассматривается причиной снижения противовирусного иммунитета и персистенции инфекции в дыхательных путях и одним из потенциальных независимых механизмов неконтролируемого течения болезни [3, 22], что имеет немаловажное значение для понимания механизма холодового бронхоспазма и клинических особенностей фенотипа неконтролируемой БА с ХГДП.
Образование комплексов АМГ с медиаторами воспаления, цитокинами, хемокинами, сигнальными молекулами, экспрессируемыми активированными факторами транскрипции, осуществляется благодаря наличию у АМГ трех сайтов связывания регуляторных лигандов: первый связывает ионы цинка; второй присоединяет цитокины, факторы роста, гормоны, ферменты, вирусы и бактерии; третий захватывает гидролазы [2]. Большинство клеток организма обладают как минимум двумя типами рецепторов трансформированных макроглобулинов, из которых наиболее широко распространенный альфа-2-макроглобулиновый/липопротеиновый рецептор (LRP-рецептор), или рецептор эндоцитоза, обнаружен не только на цитоплазматических мембранах, но и на мембранах клеточных органелл. Утилизация комплексов LRP-рецепторов с лигандами происходит путём гидролиза в лизосомах или фиксации в эндосомах, также возможен перенос комплексов в ядро клеток, где транспортируемый эффектор влияет на экспрессию генов [2]. Антиапоптотическое и антинекротическое действие АМГ состоит как в блокировании гидролаз – каспаз, запускающих реакции апоптоза, так и в связывании индуцибельной NO-синтазы [2].
Более низкая концентрация АМГ в ИМ больных БА с ХГДП свидетельствует о снижении, по сравнению с пациентами, не имеющими реакции на холод, уровня системной регуляции каскада воспалительных реакций и, возможно, о нарушении их последовательности, развивающихся вследствие холодиндуцированной реакции бронхов. Следует отметить, что при использовании назальной лаважной жидкости с целью мониторинга воспалительного поражения респираторного тракта уровень АМГ трактуется в качестве маркера экссудации плазмы крови из сосудов в ткани и показателя активности экссудативной фазы воспаления слизистой оболочки дыхательных путей [15].
Снижение уровня АМГ ассоциируется с активацией трансформирующего ростового фактора TGF-beta1, активирующего гены всех иных факторов роста, гены провоспалительных цитокинов, инициирующего апоптоз и некроз [2]. Интенсивный синтез факторов роста в условиях дефицита АМГ стимулирует пролиферативно-репаративные процессы в тканях, контактирующих с очагом воспаления. В случае, если избыток факторов роста вовремя не ограничивается их связыванием трансформированными макроглобулинами, избыточная пролиферация завершается некрозом [2].
Ввиду того, что связанное с клеточной пролиферацией и коллагеногенезом ремоделирование бронхов при астме является не только статическим компонентом, формирующим бронхиальную обструкцию, но и компонентом, участвующим в воспалительном каскаде и персистенции воспаления [3], можно прийти к выводу о подверженности дыхательных путей больных БА с ХГДП более раннему развитию ремоделирования, вероятно, сопряженному со снижением активности АМГ. На фоне ХГДП и дефицита АМГ в бронхах стимулируются ростовые факторы, обусловливающие пролиферацию камбиальных клеток паренхимы и соединительной ткани, а также активируются деструкция и апоптоз бронхиального эпителия, связанные с высокой воспалительной и окислительной активностью МПО.
Влияние активности АМГ на проходимость дыхательных путей больных БА с ХГДП и его возможное участие в ремоделировании бронхов подтверждается полученными нами корреляционными связями (рис.). При более высоких значениях АМГ больные отвечают менее выраженной реакцией бронхов на пробу ИГХВ, а также зависимостью между реакцией бронхов (ΔОФВ1) на пробу ИГХВ и пробу с сальбутамолом, зависимостью между уровнем контроля астмы (АСТ) и проходимостью мелких бронхов (МОС50).
|
МОС50 (r=0,47; р=0,049) |
Рис. Корреляционные зависимости активности альфа-2-макроглобулина и клинико-функциональных параметров болезни у больных БА с ХГДП.
О влиянии активности АМГ на проходимость дыхательных путей у больных БА с ХГДП свидетельствует и проведённый пошаговый регрессионный анализ, в результате которого из всей совокупности заданных переменных были отобраны наиболее значимые параметры, служащие предикторами гиперреактивности бронхов. Построено линейное уравнение регрессии:
ΔСОС25-75 ИГХВ =-29,9 + 4,2×АМГИМ – 0,14×ΔМОС50 БРОНХОЛИТИК,
где ΔСОС25-75 ИГХВ – падение средней объемной скорости форсированного выдоха на уровне 25-75% ФЖЕЛ в ответ на холодовую бронхопровокационную пробу (в %), АМГИМ – содержание альфа-2-макроглобулина в индуцированной мокроте (нг/мл), ΔМОС50 БРОНХОЛИТИК – прирост мгновенной объёмной скорости форсированного выдоха на уровне 50% ФЖЕЛ в ответ на ингаляцию бронхолитика (в %). Регрессия значима с вероятностью 99,04%.
Таким образом, в дыхательных путях больных БА с ХГДП обнаружены признаки более низкой активности АМГ, соотнесенной с более значимой провоспалительной окислительной активностью МПО, чем у больных БА с отсутствием реакции на холод. Снижение системного контроля АМГ над воспалением в бронхах у больных БА с ХГДП ассоциировано с ухудшением вентиляционной функции лёгких и увеличением реактивности дыхательных путей. Вследствие того, что повышение регуляторной активности АМГ оказывает позитивное влияние на функцию внешнего дыхания пациентов, параметры активности данного реактанта острой фазы воспаления можно рассматривать с диагностических позиций. Показатель уровня АМГ в мокроте может быть использован в качестве критерия активации экссудативного воспаления, индуцированного холодовым бронхоспазмом, и эскалации персистенции хронического воспаления в дыхательных путях, связанных с усугублением клинико-функциональных проявлений болезни и нарастанием тяжести ее течения.
